β-カテニンの分解にの再構成アフリカツメガエル卵抽出

方法は、 アフリカツメガエル卵抽出物およびタンパク質分解の小分子モジュレーター用のハイスループットスクリーニングのために適応で放射性標識、ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いてタンパク質分解を分析するために記載されている。

次の実験の全体的な目標は、無細胞の生化学的ゼノプス卵抽出システムを使用して、ターンオーバーのベータカチンを分析することです。これは、まず、β-カテニン代謝回転のモジュレーターを同定するために、活性xip卵抽出物に疑わしいエフェクターを添加および/または枯渇させることによって達成されます。これは、S 35で放射性標識されたか、またはルシフェラーゼと融合したβ-カテニンを、天然条件下で積極的に分解されるXUS卵抽出物に添加します。次に、ベータカチンとタンパク質のレベルの変化を経時的に評価するために、タイムポイントを収集します。

ゼノプス卵抽出物の特定の調節がベータカチンおよび分解の速度を増加または減少させるかどうかを示す結果が、自動X線撮影および/または発光検出に基づいて得られる。この手法は、培養細胞でのパルスチェイス実験やサイクルハイデチェイス実験などの他の既存の方法よりも優れている点は、ゼノプス卵抽出物が無細胞の生化学システムを提供し、タンパク質レベルでのタンパク質調節を解析でき、活性転写の複雑さが増すことがないことです。この方法は、ベータカティナなどの主要なシグナル伝達タンパク質の調節因子を同定することにより、シグナル伝達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

ゼノプス抽出物を使用すると、パスウェイの成分を容易に枯渇させ、規定量のタンパク質を再び追加することができます。その用量依存的な影響を判断するには、新たに調製されたXUS卵抽出物を使用するか、迅速に解凍して凍結抽出物を氷上に置きます。低温ですべての操作を行い、抽出物の希釈を最小限に抑えるために、抽出物の10分の1の容量でペレット化された抗体またはアフィニティービーズを調製し、抽出物を添加する前にビーズからできるだけ多くの液体を引き出します。

ここでは、先細りの長い端を持つゲルローディングチップを使用して、抽出物をGST結合樹脂に添加します。抽出ビーズミックスを摂氏4度で1時間回転させます。次に、抽出ビーズミックスを12,600Gで4°Cのマイクロフージで30秒間回転させます。

抽出物と一緒にビーズを移さないように注意してください。枯渇した抽出物を氷上の新しいマイクロフュージチューブに移します。イムノブロッティングにより、枯渇した抽出物とビーズの両方で枯渇効率を確認します。

Tと分解はエネルギー依存性であるため、内因性のA TP貯蔵はすぐに枯渇します。したがって、堅牢なT劣化を維持するためには、エネルギー再生ミックスを使用する必要があります。テキストプロトコルに詳述されているように、20 x エネルギー回生または ER ミックスを準備します。

オーパスエッグエキスは、冷凍チューブを手で挟んで素早く解凍します。すべての抽出物が溶ける直前にチューブを氷の上に置きます。10マイクロリットルのエネルギー回生を追加します。

ゼノプス卵エキスのアリコートに混ぜます。チューブとパルスボルテックスパルススピンをすばやくフリックして完全に混合し、すぐに氷の上に置きます。分解アッセイに適した量を、氷上の予め冷却したマイクロフュージチューブに分注します。

ラジオ標識βカチンおよび分解アッセイの準備をするには、各時点で2〜5マイクロリットルの抽出物を引き出し、XUS卵抽出物でラジオ標識β-カテニン分解アッセイを実施します。まず、テキストプロトコルで説明されているように、ベータカテニンとラベル付けされた無線機を準備します。次に、1〜3マイクロリットルのin vitro翻訳β-カテニンを20マイクロリットルのxip反応ミックスに加え、チューブをすばやくフリックし、短いパルスのボルテックスで十分に混合します。

これは重要なステップです。XUS卵抽出物は非常に粘性があり、不完全な混合は、結果のパルス、スピン、および氷上での位置の一貫性に影響を与えます。ベータカテニン分解反応を開始するには、チューブを指定された時点で室温に移します。

サンプルの1〜5マイクロリットルを取り出し、すぐに5倍容量のSDSサンプルバッファーと混合して反応を停止し、分解反応が完全に終了していることを確認します。チューブを数回フリックし、激しく渦巻いてSDSページを実行します。自動X線撮影は、レーンごとに各時点の抽出物の1マイクロリットル相当を実行します。

結果は、画像、J画像定量、または他の好ましいイメージングソフトウェアを使用して定量できます。xap卵抽出物中のβ-カテニンの分解は、バンド内のβカインと標識されたラジオ標識の強度の時間依存的な減少によって証明されるべきです。β-カテニンルシフェラーゼを調製するには、非放射性標識ルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンを合成します。

完全なアミノ酸混合物を用いた転写翻訳結合システムを使用。ルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンの産生を、反応の0.5〜1マイクロリットルのルシフェラーゼ活性を測定することにより確認します。未翻訳反応混合物からの発光を測定してバックグラウンド発光を評価し、ベータカチンルシフェラーゼ分解アッセイを実行します

次に、in vitroで翻訳されたβカチンとルシフェラーゼの融合体を調製したxip反応に加えます。氷の上で混ぜてよく混ぜます。前回と同様に、抽出物を室温に移して分解反応を開始します。

示された時点で反応のアリコートを取り出し、液体窒素で凍結します。各時点で分析するために三重のサンプルを取り出します。凍結抽出物は、分析の準備が整うまで摂氏マイナス80度で保存できます。

サンプルを氷上で解凍し、処理する前にサンプルを氷上の標準的な白い96ウェルプレートに移します。ルシフェラーゼ活性については、GS GSKのβ-カテニンの3依存性分解は、XUS卵抽出物を用いて複数の方法で容易に実証できます。XUS抽出物中のS35放射性標識β−カテニンの分解は、プロテアソーム阻害剤MG1 32の添加により阻害される。

β-カテニン変異体は、野生型ベタインと比較してXUS卵抽出物中で安定化されており、GSK 3のタンパク質阻害剤は同様にβ-カテニンの分解を阻害します。最後に、xip卵抽出物からのGSK3の枯渇は、ベータカテニン分解の分解を阻害し、外因性GSK3を添加することにより救うことができます。xip卵抽出物中のβ-カテニンルシフェラーゼ分解アッセイを用いて、βカチンおよびルシフェラーゼの分解を評価しました。

βカチンとルシフェラーゼの分解速度は、タグなしβ-カテニンタンパク質とほぼ同じです。ベータカチンとルシフェラーゼの融合のための分解の調節は、基本的に非融合タンパク質と同じです。塩化リチウムの添加によりベータカチンとルシフェラーゼが阻害されたため、ベータカティナの放射性シグナルの代謝回転が変化します。.

ルシフェラーゼタンパク質は、この手順を試みている間、時間の経過に伴うルシフェラーゼ酵素活性の変化と並行しています。このアッセイを試みる前に、すべての試薬を氷上に保ち、反応を完全に混合することが重要です。このビデオを見れば、無細胞ゼノープス卵抽出システムを使用して、レギュレーターを特定し、ベータカチンと代謝回転を分析する方法について十分に理解できるはずです。