ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

この実験の全体的な目標は、二本鎖DNA分子のねじれひずみまたはねじれの変化を単一分子レベルで直接測定することです。これは、最初のアッセイで、自由軌道磁気ピンセットまたはサンプと呼ばれる2つのアッセイを使用して達成されます。官能基化された単一のDNA分子が、磁気ビーズとガラス表面の間につながれています。

円筒形の磁石がDNAを引き伸ばす力を及ぼしますが、この構成では、ビーズの角度位置は、磁石ではなく、つながれたDNAによってのみ制約され、赤い矢印で示されるようにビーズの回転が、ビーズのDNA回転熱揺らぎのねじれの変化を報告することを可能にします。そのXY位置は、円形の円環またはドーナツの上にあります。このXY位置を回転角度に変換すると、磁気トルクピンセットと呼ばれる第2の関連アッセイで、つながれたDNAのねじれの変化を監視すること、またはMTTA側の磁石がメインの円筒形磁石に追加されてビーズの角運動を拘束することが可能になります。

この磁石構成では、磁石アセンブリの単純な回転、初期のねじり緩和構成と比較していくつかの回転を適用した後のビーズ角度位置の偏差の測定、およびビーズを閉じ込める磁気トラップの剛性の較正を通じて、つながれたDNA分子に外部トルクを加えることができます。 角運動により、DNA内のトルクの蓄積を定量化することができます。従来の磁気ピンセットに比べてフォントとMTTを使用する主な利点は、核酸のねじれのトルクと変化を直接測定できることです。この方法は、DNAとRNAの外部力とトルクに対する応答をマッピングすることで、DNAとRNAのメカニズムに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の意味するところは、DNAとタンパク質との相互作用の探索にまで及びます。例えば、DNA修復、保存、または転写に関与するタンパク質 この方法の視覚的なデモンストレーションは、従来の磁気ピンセットのセットアップをいかに簡単に変更して新しい機能を与えることができるかを示しています。以下の実験で用いたセットアップは、従来の磁気ピンセットのセットアップに基づいています。

その中央にはフローセルがあり、上からLEDで照らされ、顕微鏡の対物レンズとCCDカメラで下から画像化されます。フローセルの上にはマグネットヘッドがあり、コンピューター制御のモーターを使用して上下に動かしたり回転させたりすることができます。CCDカメラからの画像は、カスタムラボビューソフトウェアによってリアルタイムで分析され、DNAテザービーズのX、Y、Z位置が決定されます。

カスタムラボビューソフトウェアは、リクエストに応じて著者から入手できます。DNAテザリング磁気ビーズを用いたフローセルを作製した後、従来の磁気ピンセットに装着し、参照ビーズに固定化された表面と、適切な長さの個々のDNA分子がテザリングされたビーズの両方を選択します。セットアップはフォントモードに変換できます。

まず、従来のピンセット構成の磁石を保持している完全な磁石ヘッドを手動で緩めます。フォント用の円筒形の磁石を保持しているマグネットヘッドと交換してください。Fに使用した円筒形の磁石をマグネットヘッドに配置する際は、選択したDNAテザーを視野内に置いてください。

この手順の最も難しい側面は、フォームジオメトリの磁石を正しく位置合わせすることです。良好なアライメントは、磁石を体系的に動かし、各ステップの後にアライメントをテストすることで達成されます。次に、位置ステージを使用してフォント内の磁石のコース位置合わせを実行し、ラボビューソフトウェアで磁石を手動で移動します。

記録ボタンをクリックして、XY位置の変動またはエクスカーションを測定します。記録されたトレースはリアルタイムで画面に表示され、X、Y、Zの位置情報を含むテキストファイルとして保存されます。ここに示すようにXYエクスカーションが弧を描いて、円筒磁石が適切に位置合わせされていない場合は、XY変動が完全な円形パターンをトレースし、コースアライメントが達成されたことを示すまで、円筒磁石を適切な方向に動かし続けて測定します。次に。

さらなる実験で必要な場合は、高解像度の自動ステージを使用してフローセルを移動させ、ビーズから約10ミクロン以内に円筒形の磁石を位置合わせすることにより、フォントの微調整を行います。次に、前と同様に、XYエクスカーションを録音します。ステージを動かし、円形の円環の変動がほぼ均一になるまでエクスカーションを記録し続けます。

最終的なアライメントを検証するには、リクエストに応じて著者から入手できるMATLABスクリプトを使用して、ヒストグラムまたはサーモグラムに変動をプロットし、均一性を検査します。DNAトルクを測定するには、フォントに使用されている円筒形磁石を取り外し、円筒形磁石と永久的な側面磁石に交換します。MTT の場合、選択した DNA テザーが視野内に留まっていることを確認します。

制御ラボビューソフトウェアの対応するパネルに磁気回転の数と速度を入力します。ここは。巻き取り回数は 5 に設定され、速度は 0.1 ヘルツに設定されます。これにより、測定中に磁石がゆっくりと回転します。

次に、matlabでは、XY位置の監視に基づく角度追跡スクリプトを使用します。これは、リクエストに応じて作成者から提供されます。角度の揺らぎを時間の関数として表示するプロット、θTが表示されます。ラボビューですべてを設定したら、録画ボタンをクリックします。

トレースは以前と同様にリアルタイムで表示されます。MATLAB では、MATLAB スクリプトを使用して、角度 θ T とビード高さ Z of T トレースのプロットを画面上に生成し、角度信号にガウス近似して角度揺らぎの標準偏差を決定します。シグマシータ。

このスクリプトは、角度変動の分散からねじりトラップの剛性を直接決定します。シグマ シータはラジアンで 2 乗されました。ここに示す式を使用すると、MTTでは、ラジアンあたり10〜1000ピコニュートンナノメートルの回転トラップ剛性を達成するのが一般的であり、これは従来の磁気ピンセットよりもはるかに低いことに注意してください。

ここでは、たとえば、回転トラップの剛性をラジアンあたり約52ブタナノメートルと決定しました。磁気トルクピンセットは、従来の磁気ピンセットに比べて回転トラップ剛性が高いため、単一分子トルクの測定に適していますが、最大トルクが発揮されるのも少なくて済みます。これは、MTTが急回転によって引き起こされる抗力トルクを相殺できないことを意味します。

したがって、回転が速すぎないように注意する必要があります。通常、約0.1ヘルツの速度で回転します。次に、DNAテザーは、磁石をゆっくりと回転させることによって圧倒され、設定された回転数だけ、そして別の角度揺らぎの痕跡を記録することによって、磁石の回転数と速度が再び制御ラボビューソフトウェアの対応するパネルに入力される。

ここでは、巻き数を 40 に設定し、レートを 0.1 ヘルツに設定しています。これにより、測定中に磁石がゆっくりと回転し、核酸テザーに蓄積されたトルクが決定されます。Nターン後、ここに示す式を使用します。ここで、山括弧は平均とシータゼロを示します。

そして、θ N は、ねじり緩和されたテザーとターンに対応する 0 回転での角度です。磁石を回転させる手順を繰り返し、必要に応じて角度揺らぎのプラトーを記録することで、1回の測定で分子のトルク応答を完全に決定することができます。二本鎖DNAへの結合が長くなり、巻き戻される修復タンパク質RAD 51によって誘発されるDNAのねじれの変化を測定すること。

DNA rad 51をフォントにつながれたDNA分子に添加した。ここに示すように、ビードはらせん状の軌道を描きます。この動きは、DNAが時間の経過とともにどのように長くなり、巻き戻されるかを表す要素に分離できます。

DNAに蓄積されたトルクをMTTを用いて測定するために、系統的に過巻きと過少巻を持つ分子、および印加された巻数ごとに角度変動を測定しました。角度トラップの剛性について報告する角度変動の標準偏差は、適用されたターン数とは無関係である必要があります。ここでは、ここに示すように標準偏差は約9度です。

角度位置の平均は、一定の角度トラップ剛性を使用して、適用されるターン数によって系統的に変化します。平均角度の変化はトルクに変換され、DNAに保存されたトルクと適用されたターンが得られたトルクが得られます。ビーズのZ位置を同時に記録すると、DNAの長さと適用されたターンの長さが得られます。

これら2つの曲線を組み合わせることで、過巻きと過少巻きに対するDNAの完全な機械的応答が得られます。このビデオを見れば、自由軌道磁気ピンセットと磁気トルクピンセットを使用して生体分子を測定、ねじり、トルクする方法を十分に理解できるはずです。これにより、従来の磁気ピンセットを容易に適応できる新しい単一分子アッセイが可能になります。これらの技術の開発は、生物物理学の分野における研究への道を開き、例えば、DNAまたはRNAのねじり特性を研究し、DNAの圧縮および修復などのプロセスを観察するフォントおよびMTT技術は、テザーされたDNA上のタンパク質の特定の位置を決定するなどの追加の質問に答えるために、蛍光検出のような他の方法によって強化することができる。