Name: 齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶマウス精子のリン酸化ペプチド定量法。逆行性逆流洗浄で純粋な精子を分離し、トリプシン消化と二酸化チタン濃縮を行い、質量分析で精子成熟過程のタンパク質リン酸化変化を解析する。

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文化メディアと皿の調製<ol><li>ビガーズウィッテンとウィッテン（BWW）5.54グラムのNaClを添加することにより17作業溶液、0.356グラムのKCl 0.25グラムのCaCl 2、0.162グラムのH 2 KO 4 P、およびミリQ水1Lに0.294グラムのMgSO 4を200ml作る。これは、原液である、月まで4℃で保持することができる。 </li><li>ストック溶液から、飽和NaHCO 3 420mgの追加- BWWストック193 mlに、200 mgのグルコース、6mgのピルビン酸ナトリウム、600mgのウシ血清アルブミン、0.74ミリリットル乳酸ナトリウム、およびHEPES緩衝液4.0 mlで。これは実用的なソリューションであり、常に日に新しく作られ、使用する前に、37℃に平衡化する。 </li><li>カニューレを作るために、チューブが溶け出すこと（通常はメタノールの炎）などを0.4ミリメートルの内径1.1mmの外径とのポリエチレン（PE）管材を取り、弱火で開催しています。すぐにチューブを引っ張るOUTWARDは、ストレッチと外径が狭く作る。 </li><li>輸精管をより簡単にカニュレーションを可能にし、一端の狭窄を生成するためにカット。 </li><li>約15cmのカニューレのもう一方の端をカットします。平滑末端に30 G針を挿入し、（完全に後退）をそれに3ミリリットル注射器を取り付けます。 </li><li> PEチューブ（4.2g内径、6.4ミリメートル、外径）の長さ20cmに切断し、吸引口金を行う。一端にマウスピースを挿入します。 </li><li>マイクロキャピラリーガラス管ホルダーとガラスマイクロキャピラリー自体（マウス用典型的には3μL、ラットのために40μl）を挿入します。 </li></ol>マウスから精巣上体の2の除去<ol><li>各機関への具体的なIACUCが承認した手順に従ってマウスを安楽死させる。 </li><li>動物を取り、精巣上体を露出するように陰嚢に小さな切開を作る。時計師の＃5鉗子のペアを使用して空洞の外に精巣と精巣上体を引き出します。 </li><li>そのようなことを少なくとも1〜2 CMは精巣上体尾に取り付けられたまま輸精管をカット。また、精巣に精巣上体を接続する近遠心性ダクトと組織を切断し、全体の男性の生殖トラックを削除します。 </li><li> 5-40Xの順に倍率範囲で解剖顕微鏡下で全体の男性の生殖トラックを配置します。 </li></ol> 3.精巣上体カニューレを挿入<ol><li>狭め（円錐状）のエンド1-2 CMがレンズを通して自由と見えるよう顕微鏡にカニューレ、ダウンテープ。 </li><li>時計師の＃5ピンセットを取り、優しく輸精管の各側面を握るとカニューレは輸精管に入るように、カニューレ上に輸精管を引っ張る。 </li><li>非吸収性黒編み扱わ絹（サイズ5-0）の長さを取り、カニューレを挿入輸精管の周りに結び目を作る。確実に結び目が輸精管の内側カニューレを保持するためにきつく引っ張られたときに空気圧frとオム注射器が適用される。 </li></ol> 4.逆行または尾精巣上体精子のバックフラッシュ<ol><li>時計職人の＃5鉗子を使用して、精巣上体尾部の先端部をつかみ、単一の精巣上体細管を露出させるために、白膜を除去します。 </li><li>鉗子を使用して、静かに公開し、その後リリースされる精子のための開口部を作成するために、離れていじめる細管を引き出します。 </li><li>輸精管に注射器から空気を排出するようにゆっくりと3ミリリットル（マウス）または20ミリリットル（ラット）を注射器で押してください。適切な圧力では、精子がゆっくり精巣上体尾の先端に壊れた尿細管から出てくるし始めます。このとき、ガラスキャピラリーに精子を描画するためにマウスピースに吸引を適用する。注意：通常のマウスに、精子の2-3μlの動物の年齢に応じて得ることができる。ラットの意志、平均収量30〜40μlの上。 </li></ol> 5.洗濯とプロテオミクスのための準備に精子を溶解<ol><li>毛細管から背面精子を押圧するように穏やかにマウスピースに吹き込むまたはシリンジを取り付け、空気を排出することにより、BWW溶液（37℃）、1mlの溶液中にガラスキャピラリーから精子を放出する。 </li><li>精子細胞が拡散された後、夾雑タンパク質を除去し1mlのBWWで3回（300×gで、5分間）洗浄する。最終洗浄後、上清を除去。注：この時点で、精子細胞は、後で使用するために凍結することができる。 </li><li>間欠的にボルテックスしながら1時間、4％CHAPS、2 M尿素、50 mMトリス、pHが7.4を使用してタンパク質を可溶化する。 </li><li>細胞を溶解した後、遠心分離（10,000×gで、20分）、新しいチューブに上清と転送を取る。注：この時点で、タンパク質の定量を行うことができる。 </li></ol> 6.ジスルフィド結合還元およびアルキル化<ol><li>溶解したタンパク質に最終濃度として10 mMのDTTを追加し、vortexは、30分間、室温でインキュベートする。 </li><li> 50 mMのを追加し、溶解液に最終濃度としてidodoacetamide渦、暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li></ol> 7.降水<ol><li>メタノールクロロホルムは、溶解物の1の体積（例として400μl）を添加することにより、サンプルを沈殿させ、メタノール1容量（400μl）を加え、0.5容量（200μl）をクロロホルム。 </li><li>ボルテックスサンプルとスピン（10,000×gで、2分）。 </li><li>二相が遠心分離後に表示されますので注意してください。すべてが、トップ層（界面を乱さないように注意しながら）の2ミリメートルを捨てる。 </li><li>メタノールの1容量（400μL）、反転チューブは穏やかに混合し、再びスピンする1-2x追加（10,000×gで、15分）。 3-4分間乾燥したペレットを無駄にし、空気に上清を捨てる。 </li></ol> 8.トリプシン消化<ol><li> （W / W;タンパク質：トリプシン）1：50の比を1 M尿素を含む25 mM重炭酸アンモニウム中でトリプシンを再構成し、オベインキュベート好ましくはサーモミキサー上で700rpmで37℃でrnight。 </li><li>未消化物質をペレット化するためのスピン（10,000×gで、15分）。上清を新しいチューブに移す。 </li></ol> 9.リン酸化ペプチドの濃縮<ol><li>以前に18を説明したようにトリプシン消化物からリン酸化ペプチドの精製および濃縮を行ってください。 DHBバッファー中でトリプシンペプチドを10倍に希釈する[DHBバッファの構成：350 mg / mlの2,5- dihydrobenzesulfonic酸（DHB）、80％（v / v）のACN（アセトニトリル）、2％（v / v）のTFA（トリフルオロ酢酸酸）]とTiO 2ビーズ（200μgの）を乾燥させるために適用されます。 </li><li> 1時間室温で回転装置上にしておきます。 </li><li> 、DHBバッファーでサンプルを洗浄し、スピンし、上清を除去します。その後DHBを除去するために[80％ACN（v / v）を、2％TFA（v / v）で]、洗浄緩衝液で試料を3回洗浄する。 </li><li>最後の回転の後、直接に2.5％水酸化アンモニウム、pHが≥10.5溶液25μlを添加することにより溶出緩衝液を用いてリン酸化ペプチドを溶出させる。 Sピンと上清を除去。すぐに〜0.3μlのギ酸で中和する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

精子の成功と再現性のプロテオーム解析のための重要なステップは次のとおりです。出発物質の1）純度。 2）不要な塩および界面活性剤の除去;トリプシンはタンパク質の高収量を消化することを可能にするように、3）その最大限にタンパク質を変性し、4）ペプチドの損失を低減するためにサンプル処理を最小限に抑える。 成功した精巣上体尾をバックフラッシュするためには、精子が終了し、そこから領域を見つけることが不可欠である。ラットおよびマウスの両方の場合、これは、精巣上体尾部領域の中央部（ 図2A参照 ）、凹面領域の頂点である。一つは輸精管に向かってさらに付属している場合、バックフラッシュは簡単で、成功率は一般的に高いです。しかし、これは精子数の損失に来る。一つはコーパスより近位に移動しようとした場合あるいは、その後圧力の量はepididym通って精子を押し出すために必要アルダクトは、精巣上体への損傷が必然的に発生していると、しばしば非常に高いです。 精巣上体のバックフラッシュは、伝統的に精子22-25を除去するための媒体として、注射器自体に水飽和鉱油及び平衡塩溶液を用いて行われる。両方の手順は、LC-MSの潜在的に問題である。第一に、ミネラルは、そのどれもが手順に持ち越されないように注意する必要があり、基本的プロテオーム解析とケアのための世界中で使用されているナノC18ナノの列をブロックする可能性がある。これが発生した場合は、継続することは不可能であり、サンプルは、本質的に失われる。これは、これが成功したものの、我々はすぐにBWW液が接触したとすぐに精子の多くは、運動性になることを認識し、尾精巣上体と混合し、しかしBWWまたはシリンジ内の他の平衡塩類溶液を使用することによって克服することができる細胞。この問題を回避するために、我々は単に空気と精子をバックフラッシュ。だけでなく、QUALです液体ベースの方法に匹敵する精子のITYが、量は同じである。 Phosphoproteomicsは、おそらくシグナル伝達経路は、精子のポスト射精で発生している確立するための唯一の方法の一つです。私たちが調査している主要な経路の一つは、受精能のプロセスです。それが卵に結合することができる前に精子が「能」を受けなければならない。実際には、これは、一定の期間精子をインキュベートすることによって基本的に達成される（マウス40分、1.5時間、ラット;ヒト3-24時間）血清アルブミンBWW溶液に。以前、我々は、他の受精能に関与するいくつかのキナーゼの役割を示している。興味深いのは、精子を試験管内で自然発生的に泳ぐが、過剰活性26を受けることができないPKAμII農産物マウスの削除。後者は、精子が低いと、高速、低振幅から自分の遊泳パターンを変更することにより、受精能の特徴である速度、高振幅、周波数を破った。我々は、このプロセスに関与する下流のキナーゼのpp60-CSRC（SRC）を含んで示されている13,27のc-はい28およびc-ABL 14。興味深いことに、SRCの阻害は能依存チロシンリン酸化13を停止します。しかし、これは、SRCを直接チロシンリン酸化29の一般的な発症に関与していないが、ホスファターゼ29を調節し得ることを示唆し、オカダ酸を克服することができる。精巣上体から精子を強制的に媒体としてBWWを使用する際の問題は、一旦活性化され、マウスの精子のみcapacitateに約40分かかるである。精子の単離は5分/マウスをとることができ、多くの場合、いくつかのマウスを実験に使用されていることを考慮すると、精子は、実験の開始時に成熟の異なる段階であろう。これを克服するために、空気圧がガラスカニューレに尾精巣上体の精子をプッシュするために使用することができる。だけでなく、すべての精子INACTですアイブと本質的にそれらが尾環境に見られるように、それは、非運動性と運動性phosphoproteomicsを比較することが可能となる。 二つの異なる機能状態で精子を比較するときphosphoproteomicsためのサンプル処理は最小限に保たれるべきである。タンパク質沈殿1）の他の従来の方法を超えるメタノールクロロホルムの使用は、2）塩および脂肪のほとんどすべての痕跡を除去し、3）TCA 19を介して少量のタンパク質を沈殿させるための実証済みの能力を有する、余分な洗浄工程の必要性を減少させる。 （トリプシン消化を助ける）、タンパク質を変性させるためにこのヘルプを行いますが、細胞内に存在するMS-互換性の代謝物の多くが削除されていないだけので、事前のトリプシン消化に対するタンパク質沈殿をお勧めします。 精子ホスホペプチドの比較は多くの方法で行うことができる。別のものと基本的なレベル、1サンプル中の特定されリン酸化ペプチドの単純な比較、時「スペクトルカウント」として知られるプロセスでサンプルを行うことができる。初期のプロテオミクス研究は低いの複製を使用していたので批判は基本的に、このアプローチにされている（充実した議論のためLundren ら 30を参照）。より洗練されたアプローチは、ペプチド、親質量の強度を見て、他のサンプル（ラベルのない比較）でこれを比較することである。 図4に示す例では、m / zが650〜から非運動性から（ 図4の上面）には存在しないが、運動中に存在するペプチド（ 図4下）精子を見ることができる。 MSに基づくラベルフリー定量化とも呼ばれるこのプロセスは、無標識戦略である。 一般的プロテオミクス定量化するために必要な実験の量を減少させるために使用される代替の戦略は、同位体を使用することである。同位体の質量が異なるように、質量分析計はELUTの強度を比較することができるるペプチド。しかし、ほとんどの他の細胞型とは異なり、いくつかの同位体標識は、精子には適用できない。例えば、安定同位体（軽量版が他に追加されながらつの重同位体は、一つのサンプルに追加される）の添加は、組織培養に用いることができる。同位体は、タンパク質に組み込まれ始めるとき、プロテオミクス分析は、2つのサンプル（多重化）を組み合わせることにより行うことができる。しかし、精子の場合には、これは）は、単に1）同位体標識は、組織培養および2）8まで（いくつかの通路を必要とするという事実によって、行うことができない精子細胞は、全く核遺伝子の転写および翻訳を持たず、従って彼らはとにかくすべてのタンパク質に同位体を組み込むことができません。これを回避する一つの方法は、しかし、これらは悪名高く高価で、放射性標識したマウスを注文することです。別のアプローチは、化学タグを使用することである。非受精能マウスは受精能のマウスと比較したときに行われている。この場合、D 0およびDで<sub&gt; 3 -labelは、質量分析計31における一つのサンプルと他とを区別するために使用された。他のアプローチは、リシンが異なる質量同位体と化学的に標識されていることにより、例えばiTRAQ（相対的および絶対的定量のための同重体タグ）の使用を含むことができる。 ICAT（同位体コード親和性タグ）システインが異なる質量同位体および重および軽水のラベルで標識される。 それぞれ、すべての場合において、しかし、一つのことを念頭に置いておく必要がある。 MSは唯一の試料中に存在するものを報告し、これは、その時点までそのサンプルに起こったすべてのものを反映している。各ステップでの収率を最大にしながら、試料の取り扱いを最小限に抑えることが成功したプロテオーム解析のために必要である。

精巣から現れた、精子がまだ非常に顕著に区別され、これらの細胞は、1,2-未熟である。そのようなものとして、それらは泳ぐ卵母3に結合する能力を含む完全な機能性を欠いている。精子細胞のさらなる成熟が必要であるが、それらの細胞分化過程のこの段階で、それらは、遺伝子転写、さらにタンパク質生合成4ことができないので、これは、標準的な経路を介して起こることができない。彼らは精巣を離れて、精巣上体5として知られる男性生殖器系の一部を入力するなどの生物学的能力は、精子に付与されている。精巣上体は、輸精管に（精巣の）遠心性ダクトを接続し、すべての男性の哺乳類6に存在しているしっかりとコイル状、高度に差別化された管である。精子は徐々にCRで刻々と変化する管腔環境に依存して、精巣上体の降下中に彼らの受精の可能性を獲得地元の精巣上体上皮細胞7によってeated。精巣上体環境の行為に存在する様々な分泌および再吸収性の活動はそのタンパク質、炭水化物と脂質組成物6を変え、精子自体を変更します。精巣上体の重要性、特にこの構造体の初期の「頭」領域は、外科的なライゲーション技術8を用いて例示されている。輸出管結紮によって、精巣内に保持精子が完全に卵母細胞9-11を受精するためにどんな能力に欠けている。 精巣上体の環境に加えて、精子の作業内シグナル伝達経路は、翻訳ポスト既存の精子細胞の補体を変更する。例えば、精巣上体の初期領域からの精子は、これらの後者の地域5,12に比べてタンパク質リン酸化の異なるパターンを表示する。 C言語で広大な違いがあるので、これは驚くべきことではないこれらの地域からの精子のapability。たとえば、初期の、頭の精巣上体から精子がimmotiliteです。対照的に、尾部領域から精子細胞を前方回等張媒体中に置かれた前進運動を受ける。精巣上体精子細胞は、 デノボタンパク質生合成することができないので、精子の機能を調節するすべての本質的な経路は、翻訳後修飾（PTM）を介してでなければなりません。それゆえ、そのプロテオミクスを理にかなって、私たちは精子細胞の成熟を理解するのであれば、特にリン酸化などののPTMの調査は、主要な推進力である必要があります。 別の方法は、13-16レトロバックフラッシュを使用するepididymidiesから精子を得る。この技術は、確かに多くの時間がかかり、オペレータによる熟練度が大きくかかりますが、一貫して得られた精子は、99.99％を超える純度を示す。加えて、すべての他の技術とは異なり、精子CAnは、それが可能な精子の運動が開始されるかを研究すること、静止状態で単離する。試料調製は、プロテオーム解析のための最も重要な側面であるため、精子の単離は、精子プロテオミクス研究の最も重要な側面の一つとなっている。このプロトコルは、精子が精巣上体尾から分離されている方法について説明しています。これに続いて、TiO 2のリン酸化ペプチドの濃縮手順は、高度に分化した精子細胞からペプチドを抽出する方法についての具体的な参照して、概説する。 MSアプローチは（運動性、受精能、先体は、等を反応させた）精子を研究するために、この強力なアプローチをする1を別の状態（不動または非受精能）で尾側精巣上体精子を比較した場合に変化リン酸化ペプチドを区別するために使用することができます機能。

<table><tbody><tr><td>2,5-ジヒドロキシ-1,4-ベンゾキノン</td><td>アルドリッチ</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>2-D 定量キット</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清からのアルブミン</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア溶液 25%</td><td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td></td><td>ΣA6141</td><td></td></tr><tr><td>塩化</td><td>カルシウムシグマ</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3-[3-(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸</td><td>研究有機物</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>メルク</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td> <td>シグマ</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>シグマ</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Σ</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-L</td><td>Σ</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes(遊離酸)</td><td>Σ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ヨード酢酸遊離酸</td><td>Σ</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>乳酸</td><td></td><td>ΣL1750</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Ω</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>メルク</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>パーコール (無菌)</td> <td>VWR (GEヘルスケア)</td> <td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤 カクテル ストップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (ピアス)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素カリウム</td><td>メディカルストア</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム</td><td>メルク</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>トリス、超高純度グレード</td><td>アムレスコ(アストラル)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン金、質量分析グレード</td><td>プロメガ</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td> シ<td>グマ</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mm ポリエチレンチューブ</td><td>グッドフェロー</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30 G 針</td><td>テルモ</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3 ml シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>4.2 mm ポリエチレンチューブ</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>編組シルク (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO2ビーズ (分解カラムから)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>シグマ</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

精子は、細胞型の中で非常にユニークです。精巣で生産さが、事前カーソル円形細胞が細長く、形態学的に精子と認識されているものに分化し始めると、核遺伝子の転写と翻訳の両方がオフになります。しかし、精子は運動性や卵認識のための能力を有していない、非常に未熟である。これらのイベントの両方が一度精子トランジット精巣上体として知られている二次臓器を発生する。精子細胞は、精巣上体を通過するのにかかる〜12日経過時に、既存のタンパク質の翻訳後修飾は、細胞の成熟に重要な役割を果たしている。このように一つの主要な面は、タンパク質のリン酸化である。精子成熟の間に起こるリン酸化事象を特徴づけるために、純粋な精子細胞集団およびホスホペプチドのプレ分画の両方が確立されなければならない。フラッシング法、純粋な精子oの単離のための方法を使用してバック遠位または尾側精巣上体からF高品質と歩留まりが概説されている。可溶化、消化、及びTiO 2アフィニティークロマトグラフィーを経て精子ホスホペプチドの前分画のための手順が説明されている。単離されると、ホスホペプチドは、特定のアミノ酸残基が両方のタンパク質リン酸化事象を識別し、精子成熟過程の間に起こるリン酸化のレベルを定量するためにMSに注入することができる。

任意のプロテオーム解析からの結果の品質は、出発材料に大きく依存している。現代のMSと、試料調製のわずかな汚染が容易にピックアップされる。したがって、高純度の精子を提供する方法を選択すること、精子細胞プロテオミクスの場合には、重要である。 図1に示すように、逆行バックフラッシュは、精巣上体尾から精子細胞を取得するために使用されます。これは、1つはゆっくり添付注射器から空気の圧力を適用することができたPEチューブを輸精管をカニューレ挿入が含まれます。 図1Aは、輸精管と一緒に精巣上体尾を示しています。 図1Bは、輸精管がどこに縛られる方法のクローズアップショットですカニューレが挿入されている。そうすることで、そのように、精子は尾側精巣上体から1細管の切除された終了時に解放されている。 図2Aに示すように、精子はcaudの頂点領域から抽出され精巣上体とは、静止状態（ 図2B）でガラスキャピラリー内に吸い上げている。これは、前と運動性の活性化後の精子のphoshoproteomic分析を実行する能力ではなく、少なくともそれらの従来の「スイムアップ」方法に優るいくつかの利点を有する。精子は、1つの選択したメディアに排出することができる。 図2C（左手側）精子がBWW培地中に追放した直後にどのように見えるかを示しています。細胞の多くは、一緒に凝集されている。それらは、溶液（ 図2C、右側細胞）に均一になるまで泳いしかし、10分後の細胞の能力が実証されている。バックフラッシュ技術は、精子細胞にほとんど影響を持っているので、我々は100％の運動性に近い取得し、細胞が外部の挑発せずにメディアに急速に分散させる。典型的なバックフラッシュ実験では、精子はスイスマウスが含まれていますから回収6×10 5の間の細胞。これは、動物の年齢に大きく依存しており、マウスの異なる株から変化することができる。ノルウェーのラットでは、我々は一般的に±20％、200×10 6精子を得る。 図2Dは ​​、ラットの精巣上体尾から得た精子の純度を表します。 サンプル自体の他に、試料調製に関する主要な課題の一つは、トリプシン消化の収率。タンパク質沈殿は、MSと互換性のない、どちらも不要な洗剤および塩を除去するのではなく、タンパク質を変性させるだけでなく、主要な役割を果たしている。私たちは最高の仕事をするメタノール - クロロホルム沈殿を発見した。のみならず、この手順は、TCA沈殿19を含む他のものより優れた低濃度タンパク質を沈殿させることが報告され、それは追加の利点を有している。 TCA沈殿に続いて、それは非常に残ることができるTCAペレットの中断後、pHを再調整することが必要である酸性。 TCAの沈殿したペレットは、酸を除去し、高有機溶液中で洗浄することができますが、これは、結果の取り扱いと非再現性をサンプリングする追加されます。酸を中和するのに失敗すると、貧弱なトリプシンペプチドの収量をもたらす。メタノール-クロロホルム降水量だけでなく、速いですが、サンプルを酸性化しません。 図3は、一般的に下限と上限相間間の試料を100μgから見たタンパク質ペレットを示している。 ホスホペプチドの単離は、多数の方法で生じ得る。しかし再現性は、サンプルが、この段階を含むまでに取り扱わとされている方法によって異なります。より一般的に、現像方法の一つは、もともとマーティンラーセン18,20,21のグループによって開発されたTiO 2である。マイクロカラムに使用するための処理として説明したが、我々は、バッチクロマトグラフィーを用いて再現性のあるデータを得ることができる。プロセスの成功は、怒っている必要があり、溶出緩衝液、に大きく依存している<html>正しい組成を有するE;そうでなければ、ホスホペプチドは全く溶出されていません。 非運動性（ 図4上）における精巣上体尾の精子と運動性（ 図4下）の状態からTiO 2の濃縮リンペプチドからプロトコルおよび代表的なデータの再現性のm / zから650から670を見ることができます。我々は、これが生物学的複製物17を使用しても、非常に再現性のある技術であることを実証した。時間をかけて出現する青色スジがアセトニトリルの濃度が増加するにつれてC18ナノカラムから溶出するペプチドである。明らかに、運動性の集団（n = 3で示され、nは8は、典型的に実行される）において、ペプチドクラスターは、非運動性の範囲に完全に存在しない651.5 Daの範囲の周りのモノアイソトピック質量である。タンデム質量分析は、このペプチドを同定するために使用される。 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; 図1：精巣上体尾の精巣上体尾のカニューレ挿入（A）の写真。カニューレ自体は事前に引っ張ら端の約1〜2センチ露出するようにテープで留めている。これは、細かい＃1 5watchmakers鉗子を使用して、輸精管に挿入されている。（B）カニューレが輸精管およびカニューレの両方を含むセグメントの周囲に微細な絹を結びつけることによって適所に保持される。マウスからは、尾側精巣上体細胞および流体の約2〜3μlの1×10 6 /μlの濃度で収集されます。ラット（図示せず）から、流体の約30〜40μlを、同様の濃度で得られる。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> 図2：有能な精巣上体精子を収集するために使用されるガラスキャピラリー。 （A）尾eの頂点からの1つの尿細管<html> pididymisを単離し、壊れている。これが起こるのおおよその位置が示されている。（B）画像の上部には、空のガラス毛細管を示し、底部は、以前にバックフラッシュしたラットからの1つを示している。全く血液汚染および最小の上皮細胞の混入がない。（C）精子がまだ上体流体中原液されると、それらは活性化し始めていない。精子が最初にBWW液中に放出されると、それらはコンパクトな「文字列」（左手側）として出てくる。 10分後に精子のほとんどは、任意の外部擾乱（右側）を使用せずに溶液中に泳ぐので、電池の能力を簡単に、確立されている。（D）尾側精巣上体細胞のアリコートの写真を彼らが泳ぐ残された直後外細胞の純度を示しています。 g3highres.jpg &quot;/&gt; 図3：メタノール-クロロホルム沈殿一旦精子可溶化されている、可溶性画分をメタノール-クロロホルム、タンパク質および汚染物質の除去の変性を確実にするために沈殿している。タンパク質ペレットは、メタノール/水とクロロホルム相の界面に表示されます。このペレットを乱さないように、最上層を注意深く除去する。それは、タンパク質が失われないように上相の2〜3mm程度を残すことが一般的である。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> 図4：典型的にTiO 2富化ホスホペプチドプロファイル記載のプロトコルを使用して、尾精巣上体精子不動（上、N = 3）または運動状態のいずれかで単離した（下、N = 3）。 〜651.5 Dのモノ同位体質量を有するペプチドクラスター運動性の集団に存在するが不動のもの（矢印）で完全に存在しないことが示されている。この種の比較は、「ラベルフリー（MSベース）」と呼ばれる。ペプチド質量および保持時間は、次いで、タンデム質量分析のための化合物を標的とするペプチドが由来するタンパク質を同定するために使用される。

プロテオミクス分析は、液体クロマトグラフィー質量分析(MS)の前にサンプルを分解するために、出発物質の純度と事前分画の両方に大きく依存します。バックフラッシング技術を使用することにより、げっ歯類から純粋な精子を得ることができます。消化後、リン酸化ペプチドはTiO2を使用して濃縮できます。

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

本実験の全体的な目的は、精子細胞の成熟過程で精子内で起こるリン酸化ペプチドの変化を定量化することである。具体的には、マウスから尾端精管を摘出し、精子細胞の逆行性洗浄（バックフラッシング）を行い、細胞をマイクロキャピラリーチューブに回収する。次に、精子細胞をバランス塩溶液中に遊出させることで混入タンパク質を除去し、その後、洗浄、溶解、および沈殿処理を行い、混入した塩類や脂質を除去する。喉嚢（のう）タンパク質をトリプシンで消化した後、二酸化チタンを用いてリン酸化ペプチドを濃縮します。液体クロマトグラフィー質量分析により、タンパク質のリン酸化状態における定量的な変化が示されます。この手法は、精子が精巣上体（EPIs）を通過する際や受精能獲得中にどのようなリン酸化プロテオームの変化が起こるかなど、生殖生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は精子細胞の生物学的知見を提供してきましたが、モデル生物や、がん、神経病理学などの疾患研究、および一般的な信号伝達経路にも適用可能です。EPIsを操作する領域の解剖学的構造を判断することは困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。まず、カニュラを作成するため、1リットルのMilli Q水に以下の成分を加え、200ミリリットルのBiggers, Whitten and Whitten（BWW）作動茎溶液を調製することから始めてください。内径0.4 mm、外径1.1 mmのポリエチレンチューブを使用します。チューブが溶け始めるまで、弱火にかざします。すぐにチューブの両端を外側に引っ張って伸ばし、外径を細くします。チューブの一端を細くカットし、S deensへのカニュレーションを容易にします。反対側は約15 cmの長さにカットします。次に、鈍端に30ゲージの針を挿入し、プランジャーを完全に引いた3 mLシリンジを取り付けます。20 cmのPEチューブを切り出し、それをカニューレの一端に挿入して吸引用のマウスピースを作成します。マイクロキャピラリーガラス管ホルダーとガラスマイクロキャピラリーを挿入します。本文のプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、陰嚢に小さな切開を加え、精巣上体を露出させます。次に、5番の時計製作者用ピンセットを用いて、精巣と精巣上体を体腔内から引き出します。精管の精巣上体側から1～2 cmほどを残して、それ以外の部分を切除して取り除きます。次に、解剖顕微鏡を用いて5倍から40倍の倍率で、近位のEENT管および精巣上体と精巣を接続している組織を切り取り、雄生殖管全体を取り出します。カニューレの細い方の端を1～2 cmほど視野に入れ、5番の時計師用ピンセットとテープを用いて固定します。精管の両側をそっと挟み、カニューレの見える部分に被せます。次に、非吸収性の黒色編組処理済み絹糸を用い、時計職人用5番ピンセットを使用して、カニューレを挿入した組織の周囲をしっかりと結紮します。カテピデス（kata epi ides）の遠位端を掴み、外膜（tunica Eugenia）を除去します。単一の表皮管を露出させるために、慎重に管を露出し、精子が放出されるための開口部を作るように丁寧に取り分けます。次に、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げ、精管内に空気を注入します。この圧力により、破損した管から精子が放出されます。次に、マウスピースに吸引をかけ、精子をガラスキャピラリー内に吸い込みます。マウスピースに軽く息を吹き込むか、シリンジを装着して、ガラスキャピラリーから1 mLのプレウォームしたB WW溶液中に精子を排出します。そして、この溶液を用いて細胞を3回洗浄し、混入しているタンパク質を除去します。最後の洗浄液を除去した後、精子を冷凍保存するか、あるいは4% CHAPS、2 M チオ尿素、50 mM Tris (pH 7.4) を用いてタンパク質を可溶化し、時々ボルテックスしながら1時間インキュベートします。その後、溶液を10,000 ×gで20分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。タンパク質溶液に最終濃度10 mMとなるようDTTを加え、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質をアルキル化します。ボルテックスした後、室温で30分間インキュベートします。次に、ライセートに50 millimolarのIO acetamideを加え、ボルテックスした後、室温・遮光下で30分間インキュベートします。タンパク質を沈殿させるため、1容量のライセート、1容量のメタノール、および0.5容量のクロロホルムを混合します。サンプルをボルテックスした後、10,000 Gsで2分間遠心分離し、界面を吸引しないよう約2 mmを残して上層を回収します。1容量のメタノールを加えた後、チューブを静かに反転させ、再度遠心分離を行います。上清を廃棄し、ペレットを3〜4分間風乾させてから、トリプシン消化およびリン酸化ペプチド濃縮を行います。まず、1 Mの尿素を含む25 mMの炭酸水素アンモニウムを使用します。トリプシンを再構成するには、タンパク質とトリプシンの重量比を1:1としてF 50を加え、サーモミキサーを用いて37°C、700 RPMで一晩インキュベートします。遠心分離して未消化物をペレット化した後、上清を新しいチューブに移します。テキストのプロトコルに従って調製したDHBバッファーを用いて、トリプシン消化後のペプチドを10倍に希釈し、200 µgの乾燥二酸化チタンビーズに適用して、ローテーターで室温にて1時間インキュベートします。インキュベーション後、DHBバッファーでサンプルをもう一度洗浄し、続いて80% ACNおよび2% TFAを含む洗浄バッファーでサンプルを3回洗浄します。最終遠心分離の後、2.5% 水酸化アンモニウムを加えてリン酸化ペプチドを溶出し、直ちに遠心分離して上清を回収します。ここで示すように、0.3 µLのギ酸を用いてサンプルを酸性にします。このプロトコルの利点の一つは、精子が単離されることです。静止状態では、B WW培地への排出直後に多くの細胞が凝集します。しかしながら、10分後には分布が単峰性となり、溶液は均一になります。このビデオで説明した調製法では、通常200 × 10⁶個の精子が回収されます。この図は、ラットの尾側副精巣由来の精子の純度を示しています。サンプル調製に関する主要な課題の一つは、トリプシン消化による回収率です。サンプルのpH調整が必要となることが多いTCA沈殿法とは異なり、フェノール・クロロホルム沈殿法は迅速であり、サンプルを酸性化しません。ここに、100 µgのサンプルから通常得られる、下層と上層の界面間に位置するタンパク質ペレットを示します。以下に、本プロトコルの再現性を示します。時間の経過とともに現れる青いストリークは、C 18ナノカラムから溶出するペプチドです。モーダル集団においてアセトニトリルの濃度が高くなると、非レンジでは完全に消失している約651.5 Daltonsのペプチドクラスターが存在します。リン酸化ペプチド濃縮プロトコルは効率的な手法です。本手順を実施する際は、プロテオミクスにおいて再現性のある結果を得るために、サンプル調製が極めて重要な要素であることを忘れないでください。この手法を応用して糖タンパク質を単離することができ、それによって、プロテオームのシアル酸含有量に変化が生じているタンパク質はどれか、といったさらなる疑問に対する答えを得ることが可能です。

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この尿細管スカッシュ手法の目的は、急速に細胞の完全性を維持しながらマウス精母細胞の開発の細胞機能を評価するためです。このメソッドにより、精子形成のすべての段階の調査のため、マウスの減数分裂の研究のため他の生化学的な分子の生物学的アプローチと一緒に簡単に実装することができます。...

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

本研究では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 によって Rab10...

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

このプロトコルでは、抽出し、前立腺癌細胞株あるいは質量分析を用いたプロテオミクスによるリン酸化プロテオーム解析のためのティッシュから調製したカゼインホスホペプチドを豊かにする手順について説明します。...

前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調べる定量的ラベル無料質量と相まってリン酸化ペプチド濃縮

パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18)...

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

マウス精子容量中の糖質および酸化リン酸化のリアルタイム変化を監視する細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。...

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

このプロトコルは、イオンチャネル活性を直接記録することを目的として、全細胞構成の哺乳類精子細胞からの電気記録を行う方法を説明しています。この方法は、いくつかの精子イオンチャネルの電気生理学的プロファイルを記述するのに役立ち、それらの分子同一性と調節を明らかにするのに役立ちました。...

哺乳類精子細胞の原形質膜を横切る電流の記録

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。...

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。...

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

ここでは、マウスの初期セグメント(間質注射)および尾部上体(血管内注射)における炎症刺激誘導のための2つの異なる外科的注射モデルを記述しています。これらの手法により、エピディジムの異なる領域における領域特異的反応の研究が可能となります。...

病原体関連分子パターンによる精巣上体炎のマウスモデル

学ぶマウス精子のリン酸化ペプチド定量法。逆行性逆流洗浄で純粋な精子を分離し、トリプシン消化と二酸化チタン濃縮を行い、質量分析で精子成熟過程のタンパク質リン酸化変化を解析する。

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

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