齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

次の実験の全体的な目標は、精子細胞の成熟中に精子内で発生するリン酸化ペプチドの変化を定量化することです。これは、マウスから甘えん坊精巣上体を取り除き、精子細胞の逆行性バックフラッシングを行い、細胞を微小毛細管に集めることによって達成されます。次に、精子細胞をバランスの取れた塩溶液に泳ぎ出して、汚染タンパク質の除去を可能にし、次にそれらを洗浄し、横たわらせ、沈殿させて汚染塩と脂肪を除去します。

窯状タンパク質はトリプシンを使用して消化され、次に二酸化チタンを使用して濃縮され、リン酸化ペプチドが濃縮されます。その結果、液体クロマトグラフィー、質量分析に基づくタンパク質のリン酸化状態の定量的変化が示されました。この方法は、精子がEPIを通過するときや受精能力獲得中にリン酸化タンパク質の変化は何かなど、生殖生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法は精子細胞生物学への洞察を提供しましたが、モデル生物、癌などの疾患研究、神経学的病理、および一般的なシグナル伝達経路にも適用できます。この方法は、EPIが操作される領域の解剖学的構造を決定するのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。200ミリリットルのビガーズ、ウィッテン、ウィッテン、またはBWWの作業用茎溶液を作ることから始め、1リットルのミリQ水に以下を追加してカニューレを作ります。

内径0.4mm、外径1.1mmのポリエチレンチューブを使用。チューブが溶け始めるまで弱火で保持します。すぐにチューブの端を外側に引っ張って伸ばし、外径を小さくします。

チューブを切断して一端を狭くすると、Sデバイスのカニューレ挿入が容易になります。反対側の端を約15センチに切ります。次に、30ゲージの針を鈍い端に挿入し、完全に格納された3ミリリットルの注射器を取り付けます。

20センチメートルの長さのPEチューブを切断し、カニューレの一方の端に挿入して吸引マウスピースを作成します。マイクロキャピラリーガラスチューブホルダーとガラスマイクロキャピラリーを挿入します。テキストプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、陰嚢に小さな切開を行い、エピを露出させます。

次に、時計職人のペアを使用してください。睾丸と精巣上体を空洞から引き抜くための5番目の鉗子。カタ精巣上体から広大な敬意の約1〜2センチメートルを除くすべてを取り除くためにカットします。

次に、近位のEENT管と精巣をつなぐ組織を切除し、5倍から40倍の倍率を使用して解剖顕微鏡で男性の生殖トラック全体を取り除きます。カニューレの狭くなった端の1〜2センチを視野に入れ、テープを使用して5番の時計職人の鉗子で固定します。広大なディフレクションの両側をそっと握り、カニューレの見える部分に引っ張ります。

次に、非吸収性の黒い編組加工されたシルクで、時計職人を使用してカニューレ組織の周りにしっかりと結び目を作ります。5番の鉗子。kata epi idesの遠位端をつかみ、チュニカEugeniaを取り外します。

表皮尿細管を1つ露出させるには、尿細管をそっと露出させてからかい、精子が放出される開口部を作ります。次に、注射器のプランジャーを静かに押し下げて、広大な敬意に空気を排出します。圧力により、精子は壊れた尿細管から出ます。

次に、マウスピースに吸引力を加えて、精子をガラス毛細血管に引き込みます。マウスピースにそっと息を吹き込むか、注射器を取り付けて、ガラス毛細血管から精子を戦前のB WW溶液1ミリリットルに排出します。そして、溶液を使用して細胞を3回洗浄し、汚染されたタンパク質を取り除きます。

最終洗浄液を取り除いた後、後で使用するために精子を凍結するか、4%チャップ、2モルチオ尿素、および50ミリモルトリスpH7.4を使用してタンパク質を可溶化し、断続的なボルテックスで1時間インキュベートします。次に、溶液を10, 000GSで20分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してジスルフィド結合を減少させ、DTTでタンパク質を最終濃度10ミリモルでタンパク質溶液にアルキル化します。ボルテックスし、室温で30分間インキュベートします。

次に、50ミリモルのIOアセトアミドをライセートボルテックスに加え、暗所で室温で30分間インキュベートします。タンパク質を沈殿させるには、1容量のライセート、1容量のメタノール、および0.5容量のクロロホルムを組み合わせます。サンプルをボルテックスした後、10, 000Gで2分間回転させ、界面の吸引を避けるために約2ミリメートルを残して最上層を収集します。

メタノールを1容量加えた後、チューブを静かに反転させ、再度回転させます。上清を捨て、ペレットを3〜4分間風乾させて、トリプシン、消化、リン酸化ペプチドの濃縮を行います。まず、1つのモル尿素を含む25ミリモルの重炭酸アンモニウムを使用します。

トリプシンを再構成するには、トリプシンに対するタンパク質の重量比1重量あたりF 50を組み合わせ、サーモミキサーで摂氏37度、700RPMで一晩インキュベートします。未消化の物質をペレット状に回転させた後、上清を新しいチューブに移します。テキストプロトコルに従って調製したDHBバッファーを使用して、トライ初期化ペプチドを10倍に希釈し、それを200マイクログラムの乾燥酸化チタンビーズに適用し、インキュベーション後室温で1時間回転子でインキュベートし、DHBバッファーを使用してサンプルをもう一度洗浄してから、80%A CNと2%TFAからなる洗浄バッファーを使用してサンプルを3回洗浄し、最終遠心分離後、リン酸化ペプチドを溶出します。紡糸して上清を回収した直後に2.5%水酸化アンモニウムを添加します。

ここに示すように、0.3マイクロリットルのギ酸を使用してサンプルを酸性化します。このプロトコルの利点の1つは、精子が分離されることです。静止状態では、B WW培地に排出された直後に多くの細胞が凝集します。

しかし、10分後にはモーダルになり、溶液は均一になります。このビデオで説明されている調製は、通常、10の6つのゾアの200倍を生成します。この図は、ARラットCota epididymus由来の精子の純度を示しています。

サンプル調製に関する大きな問題の1つは、トリップと分解による収量です。TCA沈殿とは異なり、サンプルのpHを調整する必要がありますが、フェノールクロロホルム沈殿は迅速で酸性化しません。ここに示されているサンプルは、通常、下部界面と上部界面の間の100マイクログラムのサンプルから見られるタンパク質ペレットを示しています。これがこのプロトコルの再現性です。

時間の経過とともに現れる青い縞は、C 18ナノカラムから示唆されるペプチドです。アセトニトリルの濃度がモーダル集団で増加すると、約651.5ダルトンのペプチドクラスターが非範囲に完全に存在しません。一度、リン酸ペプチド濃縮プロトコルは効率的な技術です。

この手順を試行する際には、サンプル調製がプロテオミクスの再現性のある結果を得るための重要な側面であることを覚えておくことが重要です。この方法は、糖タンパク質の単離に適応させることができ、どのタンパク質がプロテオームのシック酸含有量の変化を受けるかなどの追加の質問に答えるために使用できます。