4.14: ニワトリ胚のex ovo 培養

ヒヨコは、その発生のほとんどが母親の外で行われるため、発生経路の研究のための用途の広いモデル生物です。それにもかかわらず、卵殻は、ある種の実験のために胚へのアクセスを妨げます。幸いなことに、ひよこは殻の外で孵化することができます。一般的に入手可能ないくつかのラボ用品を使用します。このビデオでは、ex ovo培養の原理、2つの異なる培養方法の段階的な手順、および発生研究におけるこの技術の応用について学びます。

ヒヨコをex ovoで育てる方法について話す前に、テクニックのいくつかの原則を見ていきましょう。卵の中で、ひよこは卵黄を囲むビテリン膜と密接に関連して発達します。残りの容量にはアルブミン、または卵白が充填されており、これは胚を保護し、タンパク質の供給源として機能します。

殻の外側での培養は、単純な容器内のすべての卵内容物を使用して、全卵黄培養を介して行うことができます。あるいは、胚組織を切除し、ex ovo外植片培養で増殖させることができる。これらの手法はどちらも、窓付き卵の使用に比べて明確な利点があります。

まず、後期のニワトリ胚のウィンドウ化は、ひよこを囲む膜内に発達する多くの重要な血管が存在するため、複雑になります。これにより、ex ovo法は、後の段階でひよこを扱うのに適しています。

第二に、イメージングリグ内に収まるため、ex ovo培養セットアップは高解像度イメージングにより適しています。

さらに、殻から胚を採取すると、マイクロサージェリーやマイクロインジェクションなどの実験的操作のために、より多くの組織が露出します。

ひよこは保護と必須ミネラルのために卵殻に依存しているため、この構造なしで胚が生存するには特別な注意が必要です。たとえば、ハウジングは無菌で湿度の高い環境を維持するように設計する必要があり、栄養素はアルブミンまたは培地の形で提供する必要があります。長期培養のためには、カルシウム源として破砕殻も必要となります。さらに、胚を支える膜の張力は正常な発生にとって重要であるため、ex ovo培養の成功は、正常な膜形態を維持するハウジングにさらに依存します。

基本がわかったところで、いよいよチキンアウトの番です。全卵黄ex ovo培養用の卵を準備するには、まず37.5で卵をインキュベートしますか?Cは目的のステージの直前まで。

待っている間に、ハウジングを準備してください。ペトリ皿、計量ボート、ハンモックは、卵の内容物を保持するために一般的に使用されます。まず、UV光またはエタノールで処理することにより、すべてのコンポーネントを滅菌します。

さらに、インキュベーション中の湿度を維持するために、滅菌水で満たされた外側のチャンバーを準備します。

卵子の準備ができたら、胚が上に上がるように数分間水平位置に置きます。次に、殻の底を割って、卵の内容物を慎重にハウジングに移します。最後に、湿度を維持するためにハウジング容器を覆い、下流の処理のために希望の年齢に達するまでセットアップをインキュベーターに入れます。

代替のex ovo戦略であるexplant cultureは、胚を殻から取り除いた後、いくつかの追加ステップを必要とします。

この技術では、ビテリン膜を卵黄から穏やかに分離し、発生中の胚を運びます。

次に、張力を維持するためにメンブレンは取り付けられますが、これはガラスリングの周りに組織をしっかりと引っ張るか、フィルターペーパーに接着するだけで行うことができます。

マウント後、組織を覆うように培地を添加し、胚を加湿チャンバーに入れます。

摘出された胚は、最大24時間のさらなる発生のためにインキュベーターに戻すことができるようになった。

ex ovo文化の原理と方法を学んだ後、私たちはいくつかの家禽の遊びの準備ができています。

ex OVO培養は、古い胚の遺伝子発現を変更する必要がある場合に特に有用です。これに対する1つのアプローチがエレクトロポレーションであり、電流を使用して細胞膜を透過化し、遺伝物質を送達します。ex ovo培養胚はイメージングにも非常にアクセスしやすいため、全胚の蛍光イメージングを通じて遺伝物質の取り込みを簡単に検証できます。

ex ovo培養を用いて細胞動態のリアルタイムイメージングも可能です。ヒトのがん細胞は、ニワトリ絨毛尿膜(CAM)の血管を吸収することで腫瘍を形成することができます。腫瘍形成後、蛍光粒子を直接血流に注入し、リアルタイムで追跡することができます。腫瘍組織中の粒子の蓄積は、血管新生、または新しい血管の形成の指標として使用できます。

全胚は外植片技術を使用して培養できますが、一部の実験では、培養前に胚組織を解剖する必要があります。例えば、発達中の神経組織を切除し、ガラスカバーのスリップ上で成長させることができます。インキュベーション期間の後、神経堤として知られる特定の細胞集団が組織から離れて移動するのを観察できます。その後、実験薬による処理とタイムラプスイメージングを使用して、細胞移動を制御する因子を試験することができます。

JoVEのchick ex ovo文化のガイドを見ました。このビデオでは、ex ovo培養の原理、全卵黄および外植片法の基本、およびこれらの技術が今日の研究室で使用されている方法の一部について説明しました。ご覧いただきありがとうございます!