合わせたインビボ光とμCTイメージングマウスにおける整形外科インプラント感染で感染症、炎症、および骨解剖学を監視する

この手順の全体的な目標は、整形外科の大腿骨釘打ちの細菌浸潤のマウスモデルをモデル化し、視覚化することです。これは、まず医療グレードのチタンキルシュナーワイヤーをLyse EGFPマウスの大腿骨に外科的に移植することによって達成されます。第2ステップでは、インプラントに生物発光細菌を接種します。

次に、生体発光シグナルをシーケンシャルin vivo光学イメージングにより定量し、インプラントをマイクロCTイメージングにより可視化します。最終的に、生物発光シグナルの定量化により、感染過程全体にわたる細菌負荷のモニタリングが可能になり、マイクロCTイメージングにより、感染中に発生する骨の品質と寸法の変化を視覚化できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、外科的技術があまり寛容ではないため、苦労するでしょう。

特に、非対称に埋入されたインプラントは、大腿骨を骨折させ、動物の痛みを増大させ、データポイントの信頼性を低下させる可能性があります。このマウスモデルは、ヒトの整形外科インプラント感染症の特徴である敗血症性関節炎、骨髄炎、人工関節周囲骨溶解症、骨損傷における防御免疫応答とメカニズムを評価するための貴重な前臨床モデルシステムを提供できる可能性があります。次に、研究専門家であるYew Wang博士と、無菌条件下での研究室の検査技師であるJonathan Ianの協力を得て、外科的処置を実演します。

適切なPPEを使用すると、麻酔をかけた12週齢のオスの灰汁、EGFPマウスの鎮静がつま先つまみで確認され、次に手術膝を剃った後、70%アルコールとベタジンを含む3つの交互のスクラブが続きます。次に、右膝関節を覆う皮膚に正中線切開を行い、切開を延長して伸筋メカニズムを明確に定義できるようにします。次に、内側膝蓋骨関節切開術を行い、アジン鉗子を使用して大腿四頭筋膝蓋腱伸筋メカニズムを横方向に亜脱臼します。

大腿骨の顆間ノッチがはっきり見えるようになったら、25ゲージの針と23ゲージの針を使用して、大腿骨シャフトと平行を保つように注意しながら、髄内管を手動でリーマします。非対称リーミングや大腿骨骨折の可能性を避けるために、ピンホルダーを使用して、直径0.8mmの医療グレードのチタンキルシュナーワイヤーを逆行性方向に手動で髄内管に押し込みます。ピンカッターを使用してワイヤーの端を切断し、膝関節のスペースに約1mm伸びるようにします。

次に、マイクロピペットを使用して、生物発光黄色ブドウ球菌Zen 29の1×10の2マイクロリットルを膝関節スペース内のインプラントの先端に分注します。次に、鉗子を使用して大腿四頭筋膝蓋骨複合体を正中線に戻し、吸収性の皮下縫合糸で上にある皮下組織と皮膚を閉じます。動物を2Dで画像化します。

まず、マウスの腹側を上にして、IVUSスペクトル光学全動物in vivoイメージングシステムのイメージングチャンバーに入れます。次に、発光がチェックされ、発光フィルターとして「オープン」が選択されていることを確認し、13センチメートルに等しい視野Cを選択します。次に、ウィンドウに自動が表示されるまで露光時間を下にスクロールして自動露光を選択し、[取得]をクリックして生物発光画像をキャプチャし、連続したin vivo蛍光イメージングを実行します。

横のボックスにチェックを入れ、465ナノメートルの励起フィルターと520ナノメートルの蛍光フィルターを選択します。次に、露出時間を自動までスクロールします。再度、視野Cを選択し、[取得]をクリックして蛍光画像をキャプチャし、生体画像ソフトウェアを使用して、関心領域またはROIの全フラックスとしてin vivo生物発光シグナルを定量

まず、ツールパレットのROIツールセクションを展開します。次に、円のアイコンと、視野内の対象動物の数に対応するROIの数を選択し、収集された生物発光拡散パターンの全領域を囲むようにROIのサイズを変更します。次に、ROI ツールで ROI の測定 を選択し、すべて タブと コピー タブを選択して ROI 値をコピーし、その後スプレッドシートに貼り付けます。

次に、ツールパレットの[ROIツール]タブで、一連のROIに名前を付け、[保存]をクリックします。次に、生体画像ソフトウェアウィンドウでin vivo蛍光シグナルを定量化します。そのウィンドウ内をクリックして蛍光画像をアクティブにします。

ツールパレットでROIツールを展開し、ドロップダウンメニューから保存したばかりのROIシリーズを選択して、[ロード]をクリックします。次に、もう一度「ROIの測定」をクリックしてROI測定ウィンドウを開き、マイクロCT画像取得用のスプレッドシートに値をコピーします。まず、イメージングシャトル用の大口径カバーとアダプターアームを装置に挿入します。

麻酔シラミEGFPマウスをマウスイメージングシャトルに入れ、イメージングシャトルをアダプターアームに挿入します。アームを穴に押し込み、ドアを閉めます。次に、取得パネルの上部にあるCTソフトウェアを開きます。

ドロップダウンリストからプリセット選択の60ミリメートル視野標準ダイナミックを選択すると、コントロールパネルの電圧と電流の選択を含む最適化された取得パラメータが自動的に選択されます。Iボタンを選択してライブモードをオンにし、Xおよびyxiコントロールを使用して被写体をゼロおよび90度のガントリー位置に移動し、Xキャプチャウィンドウの中央に動物を配置します。次に、Iボタンをクリックしてライブモードをオフにし、CTスキャンボタンをクリックして60ミリメートルの視野でダイナミックスキャン画像を取得します。

次に、取得した画像をDICOM形式でエクスポートし、後で3D光学画像取得のために保存します。まず、装置の表面から固体金属プレートを取り外し、シャトルを受け入れるための切り欠きのあるイメージングシャトルプレートを挿入します。マウスイメージングシャトルをマイクロCTからカットアウトプレートに移し、所定の位置にカチッとはめ込みます。

次に、取得コントロールパネルのライブイメージで、イメージングウィザードを選択し、生物発光を選択してから、ドロップダウンメニューからBacteria Reporterを選択します。モデルに適した発光は、この場合、500〜620ナノメートルで自動的に選択されます。次に、次へを選択し、マウスとしてイメージング対象を指定します自動設定が選択され、自動露出が信号品質を最大化し、飽和を回避しながら信号品質を最大にすることができます視野はCに等しく13センチメートルに設定されます。

「終了」をクリックします。その後、アクイジションパネルのシーケンスウィンドウにデライトシーケンスが自動的に入力され、ディライトデータを取得するために、アクイジションシーケンスを選択します。選択した発光フィルターごとに1つの画像が取得されます。

自動露出は、イメージングウィザードの選択に従って、各波長で最適な設定を選択します。画像の取得が完了したら、ツール パレットの下の[サーフェス トポグラフィー]タブを展開します。次に、カメラに面した動物の側面またはivus機器の上部を正確に反映する向きを選択します。

[サーフェスの生成] をクリックし、動物を含む視野の領域を切り抜きます。紫色のマスクを使用して動物の境界を定義し、[完了] を選択します。サーフェスが自動的に表示されます。

結果を[サーフェス トポグラフィー]タブに保存し、タブを閉じます。次に、3D光源の位置を再構築するには、delight 3D再構築タブを展開します。生きた画像に実装された拡散光再構成アルゴリズムを使用するために、喜びシーケンスのために取得された画像はミッション波長によってリストされます。

[start]を選択すると、データプレビューウィンドウが開き、解析するシーケンスが表示され、自動的に計算された最適化された光学しきい値に設定されます。次に、[再構築] を選択して、再構成アルゴリズムを自動的に実行し、光源の 3D 表現を生成します。次に、ツールバーの3DアイコンをクリックしてDICOMブラウザを開き、以前に取得したQuantum FXデータセットをダブルクリックして、ライブイメージの3Dビューにロードします。

ツール パレットで 3D 光学ツールを展開し、[サーフェス]タブの表示対象サーフェス ボックスの選択を解除して、サーフェス トポグラフィーの選択を解除します。次に、ツールパレットの3Dマルチモダリティツールセクションのボリュームタブにあるヒストグラムを使用して、マイクロCT画像に見えるスケルトンとKワイヤーインプラントを視覚化するためのルックアップテーブルを手動で作成し、関心のある特定の組織がヒストグラムのどこにあるかを判断し、スライダーツールを使用して、組織または構造が表示されるまでレンダリングをしきい値化します。次に、ヒストグラムを右クリックしてポイントを生成し、ヒストグラムのその領域を分離するための曲線を形成します。

スケルトンとK-wireインプラントデータの両方を保存した後、ヒストグラムで生成された任意のポイントをダブルクリックして、必要なコンポーネントを色分けします。マイクロCT画像解析の場合は、Quantum FXソフトウェアを使用して目的の画像を選択し、ビューアを起動します。次に、回転ツールを選択し、画像の向きを変更します。

大腿骨の縦軸を視覚化するには、測定ツールを選択し、大腿骨の長さを測定します。次に、3Dビューアを起動して3Dレンダリングを生成し、インプラント感染に関連する骨の解剖学的構造の変化を表示するようにしきい値を調整します。3Dレンダリングが大腿骨遠位部の関心領域の目的の断面に制限されるようにクリッピング平面を適用し、analyze 11.0ソフトウェアパッケージを起動します。

3Dレンダリングの作成に使用したスターVOXファイルをロードし、画像計算ツールを起動します。領域パッドツールを使用して画像をトリミングし、大腿骨を含まない平面を削除します。次に、斜め断面ツールを開き、3点オプションを使用して、大腿骨の中央、大トロカンター、およびピンの端に点を配置します。

これらのポイントを使用して斜めの平面を作成し、新しいスライスで画像を生成します。ROIツールを開き、軸間スライスを表示し、皮質骨を表示するための最小設定と最大設定を調整します。大腿骨の遠位25%に対応するスライスの輪郭を作成し、伝播領域ツールを使用してこれらの輪郭間を補間し、関心のある3D領域を作成します。

この関心領域をオブジェクト マップとして保存し、サンプル オプション ツールを開きます。次に、作成したオブジェクトマップのチェックボックスを選択し、[configure log stats] ボタンをクリックして、[volume] チェックボックスと [sample images] ボタンが選択されていることを確認します。次に、体積測定値をデータ分析プログラムにエクスポートし、Xが関心のある時間点を表すこの式を使用して、後の時点から最初の画像時点までの外側の骨の体積を正規化します。

ボーンの上に3Dの関心領域を視覚化するには、ボリュームレンダリングツールでCT画像をロードし、3Dの関心領域を含むオブジェクトマップをロードします。次に、オブジェクトを表示し、オリジナルをオンに設定し、プレビューウィンドウを開き、レンダリングタイプメニューを起動してオブジェクト合成を選択します。次に、しきい値ボタンをクリックしてしきい値を調整し、すべての時点に対して同じ固定しきい値範囲を使用してボーンとオブジェクトマップを表示します。

最後に、回転ボタンをクリックして、向きを真の前方ビューに設定します。[レンダリング]をクリックして最終レンダリングを生成し、メインボリュームレンダリングウィンドウからレンダリングを保存します。この研究では、Zen 36に感染したマウスの生物発光シグナルは、実験期間中、偽感染マウスのバックグラウンドシグナルよりも上に留まりました。

さらに、EGFPの蛍光シグナルは、初期の時点では偽感染マウスよりも高かったが、感染の過程でバックグラウンドレベルに近づき、術後の膝関節の解剖学的文脈における光学信号を3Dで視覚化し、IVUSスペクトルイメージングシステムを使用して生成された光学画像を視覚化しました。この代表的な実験では、quantum fx micro CTイメージングシステムを使用して生成されたマイクロCT画像と共登録しました。先ほど示したように、この動画で示されているように、光データは拡散光断層撮影再構成アルゴリズムを使用して3DのマイクロCT画像にマッピングされましたが、マイクロCTイメージングでは、感染中に発生する骨の品質と寸法の結果的な変化を視覚化および定量化することもできます。

以前に報告されたように、遠位大腿骨の外側の骨容積は時間とともに大幅に増加します。これらの変化を定量化するために、3D体積画像解析を実行し、時間の経過に伴う骨体積の変化を初期骨体積に正規化することができます。マイクロCT画像から予想されるように、その発生後、感染マウスでは偽感染マウスと比較して外側の骨容積が大幅に増加します。

この技術は、私たちの研究室がこのモデルを使用して抗生物質を充填したインプラントコーティングの有効性を評価し、感染した術後関節への好中球動員を促進するインターロイキン1ベータの役割を決定し、予防的および治療的な抗生物質レジメンを評価および比較する道を開きました。これらの手順に続いて、光音響イメージングなどの他の方法を実行して近赤外蛍光シグナルを検出することができ、これは感染の存在を診断するように設計された蛍光プローブの将来の開発にとって重要になる可能性があります。