16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

この手順の全体的な目標は、16 個の S-R-R-N-A をシーケンスすることです。ベンチトップシーケンシングマシンを使用して環境サンプルから増幅された遺伝子。これは、最初に改変プライマーを使用して16個のS-R-R-N-A遺伝子を増幅することによって達成されます。

2番目のステップは、増幅生成物を精製し、定量化し、それらをプールすることです。次に、アンプリコンプールを、エマルジョンPCR中にクローン的に増幅されたシーケンシング球に結合し、ベンチトップシーケンサーでシーケンシングします。最後のステップは、結果のシーケンスデータセットを分析することです。

最終的には16台のS-R-R-N-A。遺伝子アンプリコンシーケンシングは、環境サンプル中の微生物群集の組成と多様性を決定するために使用されます。この手法は、DGGやクローニングシーケンシングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、微生物群集の構成と多様性についてより深く明確な視点を得ることができる点です。

この方法は、微生物生態学の重要な質問の1つに答えるのに役立ちます、フォワードプライマーとリバースプライマーを始めるには誰がいますか?2つのX Hot Start Tacとマスターミックス、およびサンプル、フォワードプライマーとリバースプライマーの配列は、示されているテンプレートに適合します。この配列には、イオントレント固有のアダプターが含まれています。

シーケンスの開始時に信号強度を較正するためのシーケンスキー。テンプレート固有のプライマーと10塩基対バーコードを実行します。その後、使用前にプライマーとサンプルを完全に混合します。

PCR反応を準備します。0.5マイクロモルのリバースプライマー、0.4ミリグラム/ミリグラムのBSA、および1つのXホットスタートタックとマスターミックスを含む反応あたり20マイクロリットルを混合します。次に、各PCRチューブに18.5マイクロリットルのマスターミックスをピペットで入れ、それぞれ異なるバーコードを含む20ミリモルのフォワードプライマーストック溶液を0.5マイクロリットル加え、一緒に配列決定します。

次に、PCRフードの外側に、1マイクロリットルあたり1〜10ナノグラムの濃度のサンプルをPCRチューブに加えます。初期変性を摂氏95度にして5分間プログラムを設定します。その後、摂氏95度を30秒間25サイクルします。

摂氏55度で30秒、摂氏72度で45秒。最終的な伸びは、摂氏72度で10分間行う必要があります。チューブをPCRマシンにセットし、プログラムを開始します。

最終的なPCR産物は、使用するまで摂氏4度または摂氏マイナス20度に置くことができます。利用可能な最大のコームを使用して2%アロスゲルを調製します。次に、5マイクロリットルの6 x ゲルローディング色素を各PCR反応と混合し、各サンプルを空に分離するゲルにサンプルをロードします。

ゲルを70ボルトで50分間よく泳がせます。ゲルを流した後、ゲルの写真を撮り、メスを使ってバンドをカットします。各バンドは約 250 塩基対であると予想され、これには 190 塩基対の製品と、アダプターとバーコードを構成する 63 塩基対が含まれています。

次に、切除したバンドを秤量し、PCR産物のゲル抽出と精製を進めます。Kayak Quick Gel Extraction Kitなどのキットを使用して、各PCR産物をピコグリーンで定量し、希釈して、1マイクロリットルあたり10〜9分子の5倍、つまり1マイクロリットルあたり約1ナノグラムのストック溶液を得ます。一部のサンプルで増幅率が低い場合は、必要に応じて濃度を調整しますが、10の1.57倍からマイクロリットルあたり7番目の分子を下回らないようにしてください。

希釈した各PCR産物のプール10マイクロリットルをプールして、サンプルの等しいモルプールを得るために、計画されたシーケンシングランごとに1つの別々のプールを準備します。プールされたPCR産物は、エマルジョンに使用するまで冷凍庫に保管できます。まず、プールしたPCR産物を25マイクロリットルの容量で26ピカモルに希釈し、イオンPGMテンプレートキットから試薬を取り出します。

次に、PCRフードで作業し、エマルジョンPCRを調製します。プールしたPCR産物を混合すると、ベンチでの作業時に球体粒子を追加することができます。溶液をよく混ぜてから、フィルターカートリッジに混合物を挿入し、エマルジョンオイルを慎重に上にします。

次に、フィルターカートリッジをゆっくりと反転させ、カートリッジを自動エマルジョンPCR装置にロードします。次に、適切なプログラムを選択して手順を開始します。自動エマルジョンPCRが完了したら、収集チューブから上清を取り除き、チューブの底にある球状粒子を回収します。レザス。

球体を100マイクロリットルの洗浄液に懸濁し、ライブラリ定量のために2マイクロリットルのアリコートを取ります。PCR産物のシーケンシングを行うには、シーケンシングランの詳細を指定するシーケンシングランプランを準備します。次に、装置を開き、[初期化]をクリックし、プロンプトが表示されたら、洗浄液番号2、洗浄液番号1、および自動pH緩衝液をシーケンシング装置に取り付けます。

次に、初期化手順を続行し、プロンプトが表示されたら、D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-PおよびDTTPヌクレオチドをそれぞれの50ミリリットルチューブに追加します。次に、チューブをシーケンシングマシンにねじ込み、初期化手順を続行します。初期化手順が完了したら、すぐにサンプルローディング手順を開始して、シーケンシング用のサンプルを準備します。

エマルジョンPCRから濃縮された球体を15、500倍Gで1.5分間遠心分離し、チューブの底部に球体を回収します。次に、Sナチンを取り外し、チューブに正確に3マイクロリットルを残します。次に、3マイクロリットルのシーケンシングプライマーをチューブに加え、ピペットで上下に動かして粒子を再懸濁し、溶液を完全に混合します。

チューブを摂氏95度で2分間インキュベートし、次に摂氏37度で2分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、1マイクロリットルのポリメラーゼを加えてよく混合し、室温で5分間インキュベートします。混合物がインキュベートされている間に、シーケンシングチップをシーケンサーにロードし、チップの品質チェックを行います。

次に、クイック遠心分離機とマイクロ遠心分離機でチップから液体を取り除きます。7マイクロリットルの酵素球混合物をゆっくりとピペッティングし、チップに気泡が入らないようにして、サンプルをチップにロードします。サンプルがチップにロードされたら、チップを装置に挿入し、シーケンシングランを開始します。

データの解析を開始するには、シーケンシングデータサーバーに接続し、高速Qファイルをダウンロードします。次に、プライマーとバーコード情報を含むタブ区切りのオリゴファイルを作成します。次に、マザーのWebサイトからGreen Genesの参照ファイルをダウンロードし、マザーを起動して解析を行います。

画面下部に表示されているコマンドを使用して、FASTQファイルを高速で高品質のファイルに変換します。各シーケンスのグループ メンバーシップを決定し、シーケンスをトリミングします。このコマンドを使用して、Green Genes 分類法の配列を分類します。

このコマンドを使用すると、イオントレントPGMで3隻14隻の船を使用してシーケンシングした場合の平均出力は約300万から50万になります。結果が母親でフィルタリングされた後、良質な読み取りが行われます。これは、この次世代シーケンシング手順の各ステップ後のリード数の典型的な内訳であり、ここに示されているのは、16sリボソームのV、3〜4領域を標的とするプライマーで増幅され、マザーワンマスターを使用して分析された、すべての36のマルチプレックス環境サンプルの門クラスレベルでの平均コミュニティ組成です。

この手法は、適切に実行すれば2日で実行できます。このビデオを見れば、ベンチトップシーケンシングマシンを使用して16 sリボソームRNAの出願人をシーケンシングする方法を十分に理解できるはずです。