解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養
September 11th, 2014
このプロトコルは、Drosophila melanogasterの蛹からの無傷の精巣と生殖細胞系の嚢胞の解剖と栽培を説明しています。この方法により、ex vivoでの精子形成を顕微鏡で観察することができます。さらに、蛹精巣の生殖細胞発生の特定の段階に対する阻害剤の影響の薬理学的アッセイについて説明します。
この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエ、瞳孔精巣、生殖細胞嚢胞の生体外培養物を準備して、ライブイメージング研究と阻害剤治療を行い、縮瞳後を分析することです。2番目のステップは、これらの精巣から単一の生殖細胞嚢胞を解剖することであり、その後、無傷の精巣と単一の生殖細胞嚢胞をライブイメージング実験に使用できます。あるいは、次のステップは、無傷の精巣または生殖細胞嚢胞を阻害剤化合物でインキュベー
トすることです。最終的には、カボチャ、精巣、蛍光顕微鏡の免疫染色を使用して、治療の効果をモニターします。このex vivo培養技術が既存の遺伝的方法よりも優れている点は、ポストミオシス期における精子形成へのアクセスを可能にすることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、瞳孔組織を解剖して扱う必要があったため、苦労しています。
実験を開始するには、80マイクロリットルのシールドとSan M 3昆虫培地をウシ胎児血清と抗生物質と一緒に10センチメートルのシャーレに滴下します。次に、幅の広い鉗子を使用して、蛹を摘み取り、皿の上の培地の滴に移します。次に、材料を光ファイバーイルミネーターを備えた実体顕微鏡に移します。
5番の鉗子を使用して解剖する際には、精巣を室温以上に加熱しないように注意してください。蛹の最も後端をつかみ、所定の位置に保持します。別の鉗子で前球形をつかみ、瞳孔の前端でパーマを開きます。
胸部の少なくとも一部が露出するまで、瞳孔ケースをはがします。蛹の最も後端で蛹を所定の位置に保持し続け、一対の鉗子の両腕を蛹の頭部領域に挿入して、蛹の内圧を解放します。次に、鉗子を開き、鉗子を前方に動かして蛹を引き裂き、最初の試行で開口部ができるだけ大きくなるようにします。
圧力が解放される前に、蛹の後端で蛹を損傷しないようにしてください。これにより、精巣が小さな開口部から直接押し込まれ、損傷する可能性があります。蛹が開くと、蛹の解放された内圧が大きな開口部から脂肪体細胞と組織の糸球体を押し出します。
次に、1対の鉗子を使用して開口部のサイズを大きくし、精巣を損傷する可能性があるため、鉗子で蛹を圧迫しないようにします。次に、蛹の最も後端を近づけて保持します。鉗子の他のペアは、蛹の内容物を後部から前方に緩やかに縞状に押し出し、蛹から精巣を解放します。
瞳孔精巣が押し出されていないか確認してください。それらは他の組織に接続されません。24時間で、A PFは事前にカットされた200マイクロリットルのピペットチップで精巣を採取します。
精巣と一緒に運ばれる脂肪体細胞の数を減らすために、少量の培地のみを移します。次に、精巣を新鮮な培養皿の培地に入れます。精巣を培地で数回洗浄し、脂肪体細胞がわずかになるまでライブイメージングを行います。
精巣を培地を入れたガラス底培養皿に移し、倒立型イメージング顕微鏡を使用して解剖を開始します。1つ以上の瞳孔精巣を、培地で満たされたガラス底培養皿に移します。男性の生殖細胞嚢胞の解剖には、光ファイバー照明と2本のステンレス製針を備えた実体顕微鏡を使用します。
1本の針を慎重に固定し、1つの精巣をその前端または後端に置き、所定の位置に保持します。もう一方の針を精巣に挿入し、針を横に動かして精巣鞘を破壊すると、多くの嚢胞が放出されます。1本の針で精巣を所定の位置に保持し続けます。
次に、もう一方の針を使用して、精巣から残りの嚢胞をそっと縞模様にします。次に、凝集した嚢胞を分離します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、嚢胞を培地で新鮮な培養皿に移します。
次に、培養皿を倒立イメージング顕微鏡に移し、単一の嚢胞のライブイメージングを行います。必要に応じて針で嚢胞を再度分散させ、位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用して嚢胞の病期を特定します。所望の病期の嚢胞に焦点を当てる。
嚢胞の焦点と位置を頻繁に確認してください。長時間のイメージング実験では、嚢胞は培養皿の底に付着しません。ピントが合わずて浮かぶつもりです。
24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに500マイクロリットルの培地を充填し、1回の実験を12回の繰り返しで行います。次に、事前にカットされた200マイクロリットルのピペットチップを使用して、1つの瞳孔精巣を各ウェルに移します。次に、倒立蛍光顕微鏡を使用して、単離された精巣にプロタミンが存在するかどうかを確認します。
精巣には、ヒソンからプロタミンへの切り替え、またはHPスイッチがどの嚢胞でも起こっていないことを示すプロタミン、B-E-G-F-P信号がなくてもよい。すでに陽性の嚢胞を示している精巣を交換します。エンドカル酸を含有する培地500マイクロリットルを添加し、阻害化合物を最初の12ウェルのそれぞれに1ミリリットル中の最終濃度150マイクロモルに達するようにする。
残りのウェルを未処理のコントロールとして使用し、500マイクロリットルの培地に溶媒を加えます。次に、プレートを摂氏5度で暗所で24時間インキュベートします。インキュベートされた精巣にプロタミンが存在するかどうかを再度確認します。
対照精巣は、HPスイッチを介した遷移を示す1つ以上のプロタミン、BEG-F-P陽性嚢胞を示すはずです。次に、200マイクロリットルの先端が付いたピペットを使用して、精巣をポリLリジンコーティングスライドに移します。スカッシュ調製を行い、蛍光抗体で染色します。
公開されたプロトコルに続いて、ショウジョウバエ精巣の位相コントラスト画像をこの解剖法を使用して取得しました。これは、ショウジョウバエの蛹のわずかに押しつぶされた全体のマウント精巣です。PY形成またはPF形成の24時間後、精子はハブ領域の下の前部に限られます。
残りの精巣は、丸い核と位相コントラストの成長べん毛オーバーレイを伴う細長い段階の精子細胞とネビン電流期の精子細胞精子細胞で満たされており、家庭用瞳孔精巣からのEGFPおよびRFP蛍光画像は、24時間A PFでH 2つのA-V-D-R-F-PおよびプロタミンB-E-G-F-Pを検出するために取得されました。どの精子細胞も頻繁にHPの切り替えを受けたことはありません。この段階で解剖された精巣には、自家蛍光構造が含まれています。瞳孔精巣を36時間解剖したA PFは、最初のプロタミンであるB-E-G-F-P陽性の嚢胞を示します。
瞳孔精巣 48 時間 A PF には、目に見えるプロタミン陽性核を持ついくつかの生殖細胞嚢胞があります。培養中で発達している精巣全体のタイムラプスex vivoライブ画像を記録できます。この方法を使用して、瞳孔精巣を45時間解剖し、PFを培地で6時間インキュベートし、5分ごとに画像化しました。
この時間枠内で、精子細胞のいくつかの嚢胞がHPスイッチ段階から出現し、明るいプロタミンB-E-G-F-Pシグナルを示します。このビデオを見た後、in vivoイメージングまたは阻害剤治療を行うために、培養中の早期瞳孔精巣と単一の生殖細胞嚢胞を取得する方法についてよく理解しているはずです。
概要
このプロトコルは、ショウジョウバエの蛹から完全な精巣と生殖系嚢胞を解剖し、培養する方法を説明しています。この方法により、精子形成のin vitroでの顕微鏡観察が可能となり、生殖細胞の発生に対する阻害剤の影響を分析するための薬理学的アッセイも含まれています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 細胞生物学
背景
- ショウジョウバエは精子形成の研究モデルとして使用されています。
- in vitroでの培養技術は生殖細胞の発生に関する洞察を提供します。
- 薬理学的アッセイは特定の阻害剤の役割を解明することができます。
- 精子形成の理解は発生生物学研究にとって重要です。
研究の目的
- ショウジョウバエの精巣と生殖系嚢胞のin vitro培養を準備すること。
- 精子形成に関する生体内イメージング研究を行うこと。
- 阻害剤が生殖細胞の発生に与える影響を評価すること。
使用した方法
- 蛹の精巣と生殖系嚢胞の解剖。
- 反転蛍光顕微鏡を使用した生体内イメージング。
- 特定の阻害剤による薬理学的処理。
- 解析のための免疫染色と蛍光顕微鏡。
主な結果
- 精巣と嚢胞の成功した解剖と培養。
- 生体内イメージングを通じた精子形成段階の観察。
- 阻害剤が生殖細胞の発生に与える影響の同定。
- in vitro培養技術の利点の実証。
結論
- このプロトコルはショウジョウバエにおける精子形成の詳細な研究を可能にします。
- in vitro培養は発生生物学研究に貴重なツールを提供します。
- 薬理学的アッセイは生殖細胞の発生に関する重要な洞察を明らかにすることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This ex vivo culture system enables direct pharmacological interrogation of post-meiotic spermatogenesis in Drosophila, overcoming limitations of genetic approaches that confound early developmental phenotypes. By allowing live imaging and inhibitor treatment of isolated testes and germ-line cysts, the method supports mechanistic de-risking of targets involved in chromatin remodeling and epigenetic reprogramming. It provides a disease-relevant system for studying conserved mechanisms of germ-cell maturation with translational continuity to mammalian spermatogenesis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in post-meiotic germ-cell development without confounding pre-meiotic gene functions.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of targets in chromatin dynamics and epigenetic switching.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of validated biological systems for pharmacological screening of compounds affecting histone-to-protamine transition.
- Operational Value: Delivers quantitative fluorescence readouts (e.g., protamine B-E-G-F-P signal) for assay standardization and compound effect measurement.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a Drosophila-based model to study conserved mechanisms of spermatogenesis with relevance to mammalian germ-cell epigenetics.
- Operational Value: Facilitates continuity from target discovery through preclinical-like pharmacological perturbation in a genetically tractable system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling target validation and mechanistic de-risking prior to lead identification in reproductive biology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of epigenetic regulators in spermatogenesis through live imaging and pharmacological perturbation.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantifiable outputs for compound screening and dose-response analysis.
- Analytics: Generates fluorescence-based readouts (protamine, histone markers) to compare inhibitor effects across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved epigenetic transitions in germ-cell development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying multiple stages of spermatogenesis and testing diverse compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function by isolating post-meiotic phenotypes from earlier developmental confounders.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation, culture, and imaging for reproducible pharmacological assays across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epigenetic target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence in a disease-relevant germ-cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection and handling of pupal tissues under sterile conditions.
- Depends on inverted fluorescence and phase contrast microscopy for live imaging and endpoint analysis.
- Necessitates standardization of medium composition, incubation timing, and inhibitor dosing across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending the system to other pharmacological targets or developmental stages.
- Limited by the technical skill needed to isolate intact cysts and maintain viability during long-term imaging.
