放射性トレーサーで植物にミネラル栄養素や毒性物質のフラックスを測定する

次の実験の全体的な目標は、無傷のオオムギの苗の根に出入りするカリウムとアンモニアの一方向フラックスを測定し、植物膜の主要な栄養輸送システムの機能を特徴付けることです。これは、最初に特定の化学組成の水耕栽培溶液で1週間苗を育て、植物が栄養価の高い安定した状態にあることを確認することによって達成されます。水耕栽培では、実験的な操作のために根にアクセスすることができます。

第2のステップとして、無傷の植物の根を、目的の基質に放射性同位元素をスパイクした取り込み溶液を含む実験溶液に、さまざまな時間浸します。このステップは、苗木への輸送速度と苗木からの輸送速度を決定するために使用されます。次に、植物は、一方向流入実験のために短い取り込み期間の直後に解剖されるか、トレーサー放出の測定のために長い取り込み後にFLX漏斗に移されます。

トレーサー、flx、またはケイトによるコンパートメント分析を使用して、輸送システムの容量、エネルギー、メカニズム、および制御の主要な側面を明らかにすることができる結果が得られます。この方法は、ミネラル栄養素や毒物が植物に出入りする方法など、植物の栄養生理学に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。このようなフラックスは、変化する環境にどのように反応し、基質の細胞や組織の区画化にどのように影響しますか?

そして最後に、塩分、干ばつ、重金属の毒性など、農業の生態環境を損なう非生物的ストレスは、植物の栄養素のフラックスとダイナミクスにどのように影響しますか。この手法は、基質の枯渇や蓄積アッセイ、鉄選択的振動電極測定などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、流入とeFlexの違いである正味の屈曲とは対照的に、一方向のフラックスを測定できることです。そうすることで、植物栄養素や中毒物質の輸送システムの容量エネルギー、メカニズム、および調節について貴重な洞察を得ることができます。

この実験ではモデル種のオオムギを使用し、実験の1日前に温度制御された成長チャンバーでオオムギの苗木を7日間水耕栽培し、いくつかの苗木を束ねて1つの複製を行います。シュートの基部に2センチメートルのタイゴンチューブを巻き付け、チューブをテープで固定してカラーを作成します。直接流入またはDIアッセイにはバンドルごとに3つの植物を使用し、実験の1日前にトレーサー、flx、またはケイトアッセイによるコンパートメント分析にはバンドルごとに6つの植物を使用します。

DI用の次の材料と溶液を準備し、事前のラベリング、ラベリングおよび脱着溶液、遠心分離チューブ、サンプルバイアルを収集し、Kateのすべての溶液を曝気して混合します。以下をよく集めてください。混合曝気標識溶液と溶出溶液、排出漏斗、遠心分離チューブ、およびサンプルバイアル。

実験当日は、機関の放射性物質ライセンスのすべての要件に従って、ラジオトレーサーを準備してください。適切な安全装置と線量計を着用し、放射性カリウム同位体の調製には適切な遮蔽を使用してください。カリウム42。

清潔で乾いたビーカーを天びんに置き、天びんをゼロにします。トレーサーのバイアルをパッケージから取り出し、粉末をビーカーに注ぎます。マスピペット、ビーカーへの蒸留水19.93ミリリットル、続いて硫酸0.07ミリリットルに注意してください。

続いて、放射性ストック溶液の濃度が計算されます。炭酸カリウムの質量と分子量、および溶液の体積を考慮して、ガイガーミューラーカウンターを使用して、汚染を定期的に監視します。放射性窒素13同位体はサイクロトロンで生成され、DI測定のために液体として到着します。

カリウム42ピペットを使用して、ラベリング溶液中のカリウムの所望の最終濃度に到達するために必要な放射性ストック溶液の量 窒素13ピペットを使用したDI測定の場合、ラベリング溶液への放射性トレーサーの0.5ミリリットル未満の少量。ラベリング溶液を曝気によって完全に混合します。次に、1ミリリットルの標識溶液のサブサンプルを4つのサンプルバイアルのそれぞれにピペットで移します。

ガンマカウンターを使用してバイアル内の放射能を測定します。カウンターが、1分あたりのカウントまたはCPMの読み取り値が修正されるようにプログラムされていることを確認します。同位体崩壊については、短寿命トレーサーにとって特に重要であり、4つのサンプルのカウントを平均して溶液中の基質の濃度で割ることにより、マイクロモルあたりの1分あたりのカウントとして表されない標識溶液Sの比活性を計算し、オオムギの根を非放射性の事前標識溶液に5分間浸して、試験条件下で植物を事前に平衡化します。

その後、根を放射性標識溶液に5分間浸します。根を脱着溶液に5秒間移し、表面に付着している無線活動の大部分を取り除きます。次に、根を脱着溶液の2番目のビーカーに5分間移します。

細胞外トレーサーの根をさらに透明にするために、芽の基底芽と根を解剖して分離します。根を遠心分離チューブに入れ、低速の臨床グレードの遠心分離機でサンプルを30秒間回転させます。表面水分と間質水を除去するには、根の重さを量って新鮮な重さを求めます。

ガンマカウンターを使用して植物サンプル中の放射能を測定し、この式を使用して植物への流入を計算します。この手順は、ラベリング溶液を準備し、前に示したようにSノットを測定することから始めます。sを測定した後、最終容量がEIT容量の20ミリリットルと等しくなるように、各サンプルに19ミリリットルの水を追加します。

各 20 ミリリットルのサンプルの無線活動をカウントします。根をラベリング溶液に1時間浸します。1時間後、植物をラベリングソリューションから取り出し、FLXファンネルに移し、すべての根の材料がファンネル内にあることを確認します。

プラスチックカラーに小さなテープを貼って、植物を流出漏斗の側面にそっと固定します最初のeluを漏斗にそっと注ぎます。タイマーを開始して秒単位でカウントアップし、15秒後にスピゴットを開けてサンプルバイアルにEITを回収します。スピゴットを閉じて、次のEITを漏斗にそっと注ぎます。

このようにして、Elucianシリーズの残りのEITを合計29.5分間のEU期間で収集します。EUプロトコルが完了したら、先に示したように植物を収穫し、ガンマカウンターを使用してEITと植物サンプルの無線活動をカウントし、各EITの読み取り値に定常状態の溶出時間の関数としてトレーサーリリースを希釈係数プロットで乗算し、線形回帰とフラックスの計算を実行します。交換とプールサイズの半分の嘘。

ここに示されているのは、アンモニアの外部濃度の変化の関数としてのアンモニア流入の代表的な等温線です。高アンモニアまたはアンモニアで栽培されたオオムギ苗の無傷の根、および低カリウムまたは高カリウムアンモニアフラックスでは、低カリウムマッケイラで有意に高かった。等温線のメニン分析により、高カリウムはアンモニア取り込みトランスポーターの基質親和性に比較的影響を及ぼさないが、輸送能力が大幅に減少することが明らかになりました。

この次の結果は、カリウム取り込みシステムの急速な可塑性を強調しています。中程度のカリウムと高アンモニウムで育てられた無傷の大麦の苗の根で。外部溶液からのアンモニウム回収後5分以内に、カリウム流入のほぼ350%の増加が観察されました。

このアンモニウム離脱効果は、カリウムチャネル遮断薬、テトラエチルアンモニウムバリウム、セシウムに敏感でした。これらのプロットは、低カリウムおよび中程度の硝酸塩で育てられた無傷のオオムギ苗の根の定常状態カリウム42 efl、およびflxカリウムFLX上の10ミリモル塩化セシウム、5ミリモル硫酸カリウム、および5ミリモル硫酸アンモニウムの即時効果を示していますが、セシウムまたはカリウムのいずれかによって阻害されましたが、アンモニウムによって刺激されました。また、ケイトは、細胞内コンパートメント内の基質の濃度と代謝回転時間を推定するためにも使用できます。

トレーサー放出のゆっくりとした交換段階と植物組織におけるトレーサーの保持の回帰分析により、細胞壁、細胞質、vaなどの細胞内成分のプールサイズと交換の半減期に関する重要な情報を明らかにすることができます。この表は、1ミリモルの硝酸塩または10ミリモルのアンモニウムで育てられたオオムギの苗の定常状態カリウム42 flxの測定から抽出されたケープパラメータを示しています。後者は有毒なシナリオを表しています。

アンモニウムが高いと、すべてのカリウムフラックスが抑制され、プールサイズが大幅に減少します。一度習得すると、DI法の効率は、30秒間隔で治療をずらすことで向上させることができます。これにより、1回の実験で最大10の条件を調べることができます。

同様に、実行の間に十分な時間があれば、複数のKate実行を同時に実行できます。このビデオを見た後、放射性トレーサーを使用して無傷の植物の栄養素と中毒物質のフラックスを測定する方法を十分に理解しているはずです。