ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

癌幹細胞（CSCは）による化学療法耐性に対する腫瘍の再発に関与している。私たちは、選択および卵巣癌細胞株からのCSCの拡張のためのプロトコールを最適化した。化学療法剤シスプラチンで細胞を処理し、私たちは非接着CSC培養液を濃縮するメディアを促進幹細胞で培養することによる。

この手順の全体的な目標は、化学療法抵抗性卵巣がん幹細胞またはCSCを選択して分離することです。これは、最初に卵巣がん細胞株を赤色蛍光タンパク質またはRFPで蛍光標識し、蛍光活性化細胞ソーティングまたは事実を使用してRFP陽性細胞を選択することによって達成されます。手順の2番目のステップは、卵巣がん細胞株を化学療法剤シスプラチンで72時間治療し、その後、生存細胞をCSC培地で培養することです。

2日後、非付着性ステロイドが形成されます。次に、幹細胞マーカーの遺伝子発現解析を用いてCSCを、フローサイトメトリーを用いて細胞表面マーカーのCSCを解析します。最終的に、治療反応のためのCSCの解析は、シスプラチンまたはパクリタキセルで細胞を処理し、生存率を測定するためのMTTアッセイを行うことによって達成されます。

この技術が、がん細胞を高用量のパクリタキセルやシスプラチンで治療するなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、毒性の少ない化学療法剤を使用しながら、より多くの生存細胞を得られることです。この技術の意味は、CSCが新しい治療法を必要とする治療抵抗性集団を表しているため、卵巣がんの治療の改善にまで及びます。この方法は、膵臓がん、乳がん、および治療抵抗性細胞を持つ他の腫瘍タイプなどの他のシステムにも適用できます。

ジェニファーと一緒に、このテクニックを実演するのは、私の研究室のポスドクであるリロイ博士です。まず、摂氏37度の加湿インキュベーターで5%CO2のSkov 3およびO cough 4 2 9細胞株を増殖させ、細胞を40〜50%coの流暢さまで増殖させます。SCVを生成するには、赤色蛍光タンパク質またはRFPを発現する3つの細胞、RFPおよび10マイクログラム/10マイクログラムのポリブレインを発現するレンチウイルス粒子を、ペニシリンおよびストレプトマイシンの非存在下でSCV 3培地に72時間加える。

72時間後、蛍光活性化セルソーティングまたはファクトによってRFP陽性細胞を選択するか、最初にトリプシンRFPおよび非RFP発現細胞による事実を、次に遠心分離後5分間Gの125倍で遠心分離し、細胞ソーターで0.1%BSAを含むPBSに1ミリリットルあたり1000万細胞で細胞を再懸濁します。RFP 以外のセルを使用して、並べ替えパラメーターを決定します。次に、561ナノメートルレーザーを使用して高RFPを発現する細胞を収集し、がん幹細胞を濃縮します。

SCV 3、SCV 3 RFPまたはO cough 4 2 9細胞株を20マイクロモルの化学療法用シスプラチンで72時間治療します。次にトリプシンは、CSC培地中の細胞と培養生存細胞です。細胞をGの125倍で5分間遠心分離し、Resusが新鮮なCSC培地にペレットを懸濁して2日ごとに細胞をカウントし、トライアンブルー排除を行うことにより、細胞の生存率を確認することにより、2日ごとに培地を交換します。

前と同じように遠心分離機でCSCを回収し、ペレットを適切な溶液に懸濁して再活性化します。光学顕微鏡を用いて、20倍および40倍の倍率でCSC細胞の形態をモニターします。CSCを最初に特性評価するには、Gの125倍で細胞を含む培地を5分間遠心分離することにより、CSCの3つの調製物を収集します。

次に、ペレットをチオシアン酸インジウムを含むフェノールの溶液に再懸濁します。RNA抽出には、市販のCDNA逆転写キットを使用して、0.1〜1マイクログラムのRNAから相補的なDNAまたはCD NAを合成します。次に、テキストプロトコルに詳述されているように、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(略してQ-R-T-P-C-R)を実行します。

複数の蛍光色素を検出できるリアルタイムPCRサーモサイクラーを使用して、各サンプルに対してすべてのQ-R-T-P-C-Rを二重に実行します。最後のステップとして、各サンプルの幹細胞遺伝子発現をギャップDH発現に正規化します。デルタデルタCT法を使用します。

CSCを回収するには、細胞を含む培地を採取し、Gの125倍で5分間遠心分離します。500マイクロリットルの非タンパク質分解細胞剥離溶液を添加して細胞を分解し、再度遠心分離して細胞剥離溶液を除去します。次に、冷たいPBSで細胞を2回洗います。

細胞を回転させた後、細胞を標識する前に、正常な増殖培地で細胞を1時間インキュベートします。前回と同様に、抗CD 1 33 PEおよび抗CD one 17 FEを含む0.1%BSAでPBSに細胞を再懸濁します。次に、細胞を1%Paraホルムアルデヒドで一晩固定し、フローサイトメトリーを実行してCD one 17およびCD 1 33細胞表面発現を分析します。FL oneおよびFL threeチャネルの細胞に関するデータを収集し、fit Eおよびpeの両方を発現する細胞のゲートを生成します。

4つの象限を持つドットプロットを生成し、各象限プレートの細胞数を決定します。96ウェルプレート上の各細胞バリアントに対して、ウェルあたり5, 000個の細胞を一晩で。次に、細胞をさまざまな濃度のシスプラチンまたはパクリタキセルで96時間処理します。

96時間後、10ミリグラム/ミリリットルの10マイクロリットルを追加します。MTTは、沈殿物が形成されて可溶化するまで、摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。MTTです。MTT溶媒、4ミリモル塩酸と0.1%NP 40のイソプロパノールを含む溶液を加えます。

暗所で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで570ナノメートルのプレートを読み取り、シスプラチン処理を使用して上皮性卵巣がん細胞株からCSCが単離されたことを実証します。細胞株の画像は処理前に取得され、選択後に光学顕微鏡で接着の画像が取得されました。SCV 3細胞およびOCA 4 2 9細胞、ならびにSCV 3 CSCおよびOCA 4 2 9 CSCs CSCは丸く見え、組織培養プレートに付着しません。

RFPで形質導入されたSCV 3つの細胞は、CSCの単離後も蛍光を保持し、細胞が生存可能であることを示しています。実行可能です。CSC培養物は、薬物療法に対する反応について評価されました。CSCは、幹細胞遺伝子のシスプラチンおよびパクリタキセル発現に対する耐性の増加を示しました。

CD1、33、NEIN、nano、T4を調べた。初期の実験で。S SCV three CSC培養では、未処理の場合と比較して、T four nanoおよびneinが上昇しましたが、結果は統計的に有意ではありませんでした。

CD133は、未処理の細胞と比較して、SCV3つのCSC培養において有意に誘導された。これらの実験を繰り返すと、S SCVでは、親の対照細胞と比較して、T 4およびnano CSCが3増加しました。SCV 3、CSCは、ファックス分析によって明らかにされたように、CSCマーカーCD one 17の細胞表面発現の増加を示すこの手順を試みる一方で、このプロトコルの主要な制限は、CSCが生存可能なままである時間の長さであることを覚えておくことが重要である。

このプロトコルを使用すると、CSC は 1 週間未満で生存可能です。したがって、CSCの実験と分析の種類は慎重にタイミングを合わせる必要があります。シスプラチンの取り扱いは非常に危険である可能性があり、防護服の使用や皮膚や粘膜との接触を避けるなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

細胞の生存率に関する追加の疑問に答えるために、トライアムブルー排除のような他の方法を実行することができるだけでなく、CSCの腫瘍促進特性を実証するための希釈アッセイを制限することもできます その開発後。この技術は、がん分野の研究者が化学療法抵抗性につながる経路を探求する道を開きました。