ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生
2015年8月3日
ここでは、ゲンタマイシン注射による急性腎障害を誘発することにより、成人の腎臓再生を研究するための信頼性の高い方法を紹介します。損傷はゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存することを示し、in situハイブリダイゼーションを使用してlhx1a +を標識し、新しいネフロンを開発します。
次の実験の全体的な目標は、腎臓の再生を研究するために成魚のゼブラフィッシュを使用することです。これは、ネフロトキシンであるゲンタマイシンを魚の腹腔に注入して急性損傷反応を誘発することによって達成されます。次に、魚を個々の水槽に一晩保管して観察します。
この期間中、損傷したネフロン上皮が脱落し、尿細管とアヒルの内腔に集まるため、ギプス形成が発生します。負傷した魚は、キャスト形成に基づいて翌日に特定され、腎臓の再生を研究するためのさらなる実験に使用できます。この方法を最初に思いついたのは、負傷した魚が人間の損傷の既知の指標であるキャストを排泄することに気付いたときでした。
既存のゲナマイシン注射方法に対するこの技術の主な利点は、CAS形成が損傷の容易な視覚的指標であることです。生後6ヶ月から12ヶ月の成魚のゼブラフィッシュを飼育し、ゲンタマイシンとトリカの水を準備した後、テキストプロトコルに従って、プラスチック製の移送ピペットから球根をスコップ状に切断し、底の2つのスロットを切って水を排出し、準備したゲンタマイシン溶液で1ミリリットルの注射器をロードし、30.5ゲージの針を外します。次に、気泡を取り除き、シリンジの針をひねって、足首の先端が反対側を向き、シリンジのマーキングが前を向いていて読み取り可能であることを確認します。
注射後一晩観察するために魚を保持するため、および魚によって流された白い上皮キャストを観察するために、蓋付きの透明な小さな半リットルの容器を個別に準備します。魚が快適に泳ぐのに十分な魚の水で各コンテナを満たします。テキストプロトコルに従って魚に麻酔をかけた後、鰓やひれを傷つけないように頭から尾に向かって移動する魚のスコップを使用して魚をすくい上げ、魚をペーパータオルの上に置いて余分な水を吸収します横向きにそっと回して余分な水を吸収し、スコップから余分な水を振り落とします。
次に、魚を再度すくい上げ、ゼロスケールのウェイボートに置き、魚の重量を0.25グラム単位で秤量し、注入するゲンタマイシンの適切な量を計算します。スコップを使って魚を再び拾い上げ、乾いた折りたたんだペーパータオルの上に置きます。注射する場合は、右手でペーパータオルを左手で持ち、魚の頭を腹を左に向けて置きます。
簡単にアクセスできます。魚を安定させることが難しい場合は、肘を胴体に対して安定させます。次に、注射器を針で腹のクロアカの前方の皮膚に対して45度の角度で保持します。
針を皮膚のすぐ下に押し込み、角度を小さくして針を皮膚の下に前方にスライドさせ、内臓を避けます。プランジャーを適切な量押し下げ、一時停止して、針の周りに液体が出ていないことを確認します。針を引き抜く前に、魚を個々の容器に落とし、麻酔から回復することを確認してください。
魚を摂氏28.5度に一晩保ちます。注射の翌日、注入した魚を容器の暗い面に置きます。負傷した魚によって排泄された死んだ上皮組織の白いキャストが見えるようにし、魚を脇に置いて、他の魚をチェックし続けます。
適切な用量のゲンタマイシンを注射した場合、注射された魚の80〜90%がCASを生成するはずです。.casがない場合は、ゲンタマイシン注射によって魚が負傷しなかったか、魚が重傷を負い、尿管とクラコが完全に閉塞し、回復した魚の世話をするための軟組織で閉鎖されました。魚の水500ミリリットルあたり、処理グループごとに6匹以下の魚を飼い、可能であれば毎日水を交換して清潔に保ちます。
負傷から3日後。1日1回、少量の魚に餌を与え始めます。ここで見られるように、テキストプロトコルに従って損傷した腎臓を分析し、異なる用量のゲンタマイシンを使用して成体の野生型2 a bゼブラフィッシュを損傷させ、水中の腎上皮円柱の観察によって視覚的に確認されました。
怪我をした1日後。低用量のゲンタマイシンでは、ほとんどの魚にキャストがありませんでしたが、高用量では、ここで示したように、75%以上の魚がキャストを持っていました。ゲンタマイシンの投与量が異なると、再生中の腎臓に陽性の細胞凝集体であるLHXの数が増加しました。
この実験では、ゲンタマイシン1キログラムあたり80ミリグラムで損傷した後、キャストを生成した魚を2つのグループに分けました。1人は37°Cのヒートショック治療を16時間受け、その後は毎日28.5°Cの休息期間を設けました。ここに示すように、ヒートショックだけでは、LHXの密度が正の凝集体であることから観察されるような傷害反応を誘発しない。
しかし、この例は、熱ショックが損傷後7日までに熱ショック制御を行わなかった場合と比較して、負傷した魚の応答を加速し、損傷したグループ間に有意差がなくなったことを示しています。このビデオを見た後、ネフロトキシンゲンで成人のスーパーフィックを負傷させる方法をよく理解し、CAS形成に基づいて視覚的に損傷レベルを判断して、この手順に続いて腎臓の再生を研究する必要があります。シグナル伝達経路の活性化因子や阻害剤を追加するなどの他の方法を使用して、再生応答に関与しているシグナルを特定できます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、ゲンタマイシン注射による急性腎臓障害を通じて、ゼブラフィッシュの成体の腎臓再生を調査する方法を提示します。この研究は、ゲンタマイシンの投与量、環境温度、そして再生プロセスとの関係を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 再生生物学
- 薬理学
背景
- 腎臓再生は再生医療において重要な研究分野です。
- ゼブラフィッシュは再生能力によりモデル生物として機能します。
- ゲンタマイシンは腎障害を引き起こす腎毒性物質です。
- 損傷反応の理解は再生メカニズムへの洞察を提供します。
研究の目的
- 成体のゼブラフィッシュにおける腎臓再生を研究するための信頼できる方法を開発すること。
- ゲンタマイシンが腎臓障害およびそれに続く再生に与える影響を観察すること。
- 環境要因と腎臓障害の深刻さとの関係を探ること。
使用された方法
- 成体ゼブラフィッシュの腹腔にゲンタマイシンを注射すること。
- 観察のために魚を個別の水槽に収容すること。
- ネフロン障害の指標としてキャスト形成をモニタリングすること。
- 新しいネフロンの発達をラベルするためにin situハイブリダイゼーションを利用すること。
主な結果
- 損傷の深刻さはゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存します。
- キャスト形成はネフロン障害の信頼できる指標として観察されました。
- 新しいネフロンの発達はin situハイブリダイゼーションを用いて成功裏にラベルされました。
- この方法は腎臓再生に関するさらなる研究のための枠組みを提供します。
結論
- 開発された方法はゼブラフィッシュの腎臓再生を研究するのに効果的です。
- ゲンタマイシン誘発性障害はキャスト形成を通じて信頼できる方法でモニタリングできます。
- 将来の研究はこれらの知見を基に腎臓再生メカニズムを探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables reproducible nephrotoxin-induced kidney injury in adult zebrafish, providing a scalable model for studying renal regeneration mechanisms. The visual cast-based injury assessment supports high-throughput screening of compounds or genetic modifiers affecting repair pathways. Such models enhance target validation and mechanistic de-risking in preclinical nephrotoxicology and regenerative medicine programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in kidney regeneration by inducing controlled, quantifiable injury via gentamicin dosing.
- Operational Value: Provides a reproducible injury model to assess biological de-risking of targets involved in nephron progenitor activation or tubular repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates injury models with dose-dependent LHX1a-positive progenitor aggregates, enabling quantitative readouts for pathway modulation.
- Operational Value: Uses noninvasive visual cast screening to standardize injury severity across populations, improving assay reproducibility for compound testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system studies by modeling acute kidney injury and regeneration, aligning with translational biomarker discovery in renal repair.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal analysis of regeneration kinetics under variable conditions like temperature.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing a regenerating kidney platform for evaluating modifiers of repair pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nephron progenitor dynamics and injury response pathways through standardized gentamicin-induced models.
- Screening: Enables assay readiness via visual cast formation as a quantitative injury biomarker for compound or genetic screen inputs.
- Analytics: Provides LHX1a immunohistochemistry readouts to measure progenitor activation and nephron neogenesis as functional outputs.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling injury-regeneration cycles relevant to human acute kidney injury repair processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of pathway modulators across multiple project teams studying renal regeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by linking progenitor activation to functional regeneration outcomes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through dose-responsive injury scoring and environmental control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in mechanistic pathways governing renal repair.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regeneration targets based on dose- and temperature-dependent regeneration kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and anesthesia protocols.
- Depends on access to fluorescence microscopy or immunohistochemistry for LHX1a detection.
- Necessitates standardized fish housing and water quality control for consistent injury and regeneration readouts.
- Involves adaptation considerations for scaling injury models across different zebrafish strains or age cohorts.
- Limited by the need for postoperative monitoring to distinguish sublethal from lethal injury based on cast formation and survival.
