腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

癌は、腫瘍の周囲の組織だけでなく、ローカルプロ - および抗炎症性メディエーターによって影響される複雑な疾患である。したがって、むしろ皮下モデルより異方性注入モデルは、方法をより良く模倣するヒト病理における癌の進行を研究するために有用であり得る。

この手順の全体的な目標は、マウスメモリー脂肪パッドでの腫瘍細胞生着後の乳房細胞の進行を調査することです。これは、成体マウスのメモリー脂肪パッドに乳がん細胞を注入し、キャリパーで腫瘍体積を所定の時間レベルで測定することによって達成されます。実験の最後に、腫瘍の質量と体積が決定され、動物の血液と肺がさらなる分析のために採取されます。

最終的に、マクロ転移とマイクロ転移は、それぞれ目視分析と免疫組織化学分析によって定量化できます。皮下腫瘍細胞注射のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、乳腺脂肪パッド注射部位が乳房腫瘍形成の元の部位を模倣し、より信頼性の高い結果をもたらすことです。この方法は、どの腫瘍、サプレッサー、がん遺伝子、または間質コンパートメントコンポーネントががんの進行に関与しているかなど、乳がん領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。

手順の前日に、N-O-D-S-C-I-Dガンママウスの4番目の乳首から正中線まで剃り、体重を量って、すべての動物がほぼ同等の体重を持っていることを確認します。翌日、ヒト乳房腺癌細胞培養物をPBSで一度洗浄し、ほとんどの細胞が剥離したときに細胞をアニナイズします。DMEM培地を含む血清10ミリリットルで反応を急冷し、次いで室温で1,200RPMで7分間細胞をスピンダウンし、ペレットを洗浄して血清の痕跡を除去し、次いでPBS中に第2のペレットを再懸濁する。

数えた後、150マイクロリットルの濃度あたり500、000の細胞を氷上の滅菌マイクロ遠心分離チューブに分注します。次に、50ミリリットルのコニカルチューブ1本に35ミリリットルのPBSを入れ、もう1本に70%エタノールを入れ、それぞれに綿棒を浸します。すべてのツールの準備ができたら、動物の目に眼科用軟膏を塗ります。

次に、テープを使用して麻酔マウスを加熱パッドにそっと拘束し、つま先をつまんで鎮静を確認します。エタノールを染み込ませた綿棒を使用して剃った部分をきれいにし、メスの刃を使用して4番目の乳首と正中線の間に小さな切開を行います。PBSに浸した綿棒を切開部に挿入してポケットを作り、ピンセットを使用してメモリーファットパッドを露出させます。

別のピンセットを使用して、脂肪パッドの根元を絞り、組織を完全に露出させます。次に、腺癌細胞を数回上下にピペットで動かして均質な細胞溶液を作り、150マイクロリットルの細胞をインスリン注射器に穏やかに吸引します。針穴を上にして注射器を水平に持つように注意してください。

細胞を乳房脂肪パッドに注入し、組織の腫れによって注入が成功したことを確認します。次に、脂肪パッドを静かに放し、蚊の鉗子を使用して切開部を縫合し、蚊の鉗子の周りの縫合糸を時計回り、反時計回り、時計回りに回して3つの結び目を作ります。手術後、鎮痛剤を注射し、各動物を個々のケージの胸骨横臥位に置き、マウスが完全に回復するまでマウスを監視します。

細胞移植の8週間後、マウスは臓器摘出の準備をします。動物をフォームベースに固定し、ノギスを使用して腫瘍の体積を測定します。次に、長い垂直正中線切開を行い、次に前脚の真下と後脚の上の2つの水平切開を行います。

皮膚をフォームに固定して腫瘍を露出させ、はさみを使用して腫瘍を皮膚から解離します。次に、肺を静かに取り出し、左肺をボーエン溶液に3日間入れ、その後、この表在性転移性フォークが肉眼ではっきりと見えるようになります。スナップで組織の一部を液体窒素で凍結し、後でRNAを分離し、腫瘍の残りの部分をホルミンで満たされた円錐形のチューブの1つに入れます。次に、心臓穿刺によって動物を犠牲にした後、450マイクロリットルの血液サンプルを50マイクロリットルの3.2%クエン酸ナトリウムを含むマイクロ遠心チューブに分注し、次に赤血球をスピンダウンし、血漿サンプルをマイナス摂氏20度で保存します細胞の不正確な接種や漏れなどのさらなる使用実験エラーは、腫瘍サイズの変動につながるか、腫瘍の不在につながる可能性があります。記憶に似ているように見える構造の形成。

コントロールバッファーが注入された脂肪パッド。腫瘍の増殖速度は、注入された細胞株の性質にも依存し、一般にマウスの皮膚を通して観察することができます。さらに、腫瘍の周囲の領域には、血管のリモデリングから生じる大きな血管が見られる場合があり、老廃物の除去や腫瘍組織への栄養素と酸素の供給に重要な役割を果たす可能性があります。

in vitro実験とは異なり、腫瘍細胞の増殖速度は、低酸素症と栄養素の不足により、in vivoで時間的に一定ではない場合があります。周囲の組織内に壊死領域が形成されることがあり、これらの領域は腫瘍の増殖速度に影響を与えます。さらに、目的の特定の遺伝子を発現する細胞を注入すると、その遺伝子が腫瘍の成長を誘発し、腫瘍の成長が急速に始まり、最後には遅くなったり、その逆もまた然りであるため、がんの進行に影響を与える可能性があります。

ボーエンの溶液中の肺の収集は、肺組織の表面に隆起した青白い形成として現れる表在性転移性病巣を視覚化するのに役立ちます。病巣の形成は細胞株に依存します。非侵攻性細胞は微小転移のみを生じさせる可能性があり、これはパラフィン包埋肺組織へのhおよびe染色で容易に同定できます。

この手順に続いて、Elizaのような他の方法を実行して、実験腫瘍の成長が血漿中のサイトカインまたは血管新生分子のレベルにどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。