Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Daniel E. Bauer; Matthew C. Canver; Stuart H. Orkin

doi:10.3791/52118

JoVE Journal
Biology

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Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

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09:40 min

January 3, 2015

DOI: 10.3791/52118-v

Daniel E. Bauer*^1,2,3, Matthew C. Canver*¹, Stuart H. Orkin^1,2,3,4

¹Harvard Medical School, ²Division of Hematology/Oncology,Boston Children's Hospital, ³Department of Pediatric Oncology,Dana-Farber Cancer Institute, ⁴Howard Hughes Medical Institute

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article describes a protocol for creating genomic deletions in mammalian cell lines using the CRISPR/Cas9 system. The method focuses on producing loss-of-function mutations through large deletions, which are more informative for studying genes and genetic elements.

Key Study Components

Area of Science

Genetics
Molecular Biology
Cell Biology

Background

CRISPR/Cas9 is a powerful tool for gene editing.
Large deletions can provide clearer insights into gene function compared to smaller mutations.
The method aims to simplify the screening process for deletion alleles.
Electroporation is used to introduce CRISPR constructs into cells.

Purpose of Study

To establish a reliable method for generating genomic deletions in mammalian cells.
To enhance the efficiency of screening for deletion clones.
To facilitate the study of gene function through loss-of-function mutations.

Methods Used

Electroporation of CRISPR plasmids and a GFP reporter into mammalian cells.
Fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate GFP-positive cells.
Limiting dilution to obtain single-cell clones.
Conventional PCR to screen for deletion alleles.

Main Results

Successful generation of bi-allelic deletion clones.
Identification of deletion and non-deletion bands through PCR.
Confirmation of gene expression loss in deletion clones.
Demonstration of the method's efficiency and cost-effectiveness.

Conclusions

The CRISPR/Cas9 system is effective for creating large genomic deletions.
This method streamlines the process of generating and screening deletion alleles.
It provides a valuable approach for studying gene function and non-coding elements.

Frequently Asked Questions

What is the main advantage of using CRISPR/Cas9 for gene editing?

CRISPR/Cas9 allows for precise and efficient editing of genes, enabling the creation of large deletions that can provide clearer insights into gene function.

How does fluorescence-activated cell sorting (FACS) contribute to this method?

FACS is used to isolate the top 3% of GFP-positive cells, enriching for those that have successfully taken up the CRISPR constructs.

What are the key steps in the protocol?

The protocol involves electroporation, FACS sorting, limiting dilution, and PCR screening for deletion alleles.

How long does it take to complete this method?

Once mastered, the entire process can be completed in a matter of weeks.

What types of mutations can be generated using this method?

The method primarily generates loss-of-function mutations through large genomic deletions.

Can this method be applied to other cell types?

Yes, the CRISPR/Cas9 system can be adapted for various mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9は、遺伝子と遺伝的要素の破壊を生み出す堅牢なシステムです。ここでは、CRISPR/Cas9を使用して哺乳類細胞株のゲノム欠失を効率的に作成するためのプロトコルについて説明します。

この手順の全体的な目標は、CRISPR Cas nine ヌクレアーゼシステムを使用してゲノム欠失を作成することです。まず、エレクトロパスレート、2つのCRISPRプラスミドとA GFPレポータープラスミドを同時に細胞に注入します。次に、蛍光活性化細胞ソーティングを使用して、GFP発現細胞の上位3%を単離します。

次に、選別された細胞を限界希釈でプレート化し、従来のPCRを使用してバイオアレル欠失クローンをスクリーニングします。最終的に、CRISPR Cas nineは、機能喪失欠失対立遺伝子を生成することにより、遺伝子および遺伝要素の研究に使用できます CRISPR Cas nineヌクレアーゼシステムによって生成される単一のガイドRNAによって生成されるフレームシフト変異と比較して、Cas nineヌクレアーゼシステムによって生成される大きな欠失は、機能喪失変異を確実にするのに役立ちます。このアプローチにより、従来のPCRによる簡単で安価なスクリーニングも可能になります。

この方法を最初に思いついたのは、単一のガイドRNAによって作成された小さなインデルのスクリーニングが技術的に困難で、手間がかかり、高価な欠失対立遺伝子も、非コーティング遺伝要素の研究に特に有益であることを発見したときでした。各CRISPRペアペレットについて、懸濁液中で増殖させた細胞に10を2倍にします。細胞を100マイクロリットルのエレクトロポレーション溶液に再懸濁し、エレクトロポレーションQATに移します。

5マイクログラムのCRISPR Cas nineコンストラクトSG RNAAと5マイクログラムのCRISPR Cas nineを追加します。SG A Bと0.5マイクログラムのGFP発現を構築し、ピペットを数回上下に穏やかに動かして混合します。エレクトロポレーションシステムを使用して気泡が発生しないようにしてください。

滅菌トランスファーピペットを備えた2ミリメートルの獣医で250ボルトで5ミリ秒の細胞を電気ピュレートし、直ちに溶液を1ミリリットルの予熱培地に移します。細胞を摂氏30度で24〜72時間インキュベートします。細胞を滅菌済みの50ミクロンフィルターに通してファックスチューブに入れます。

次に、GFP陽性細胞の上位3%をファックスで選別し、プラスミドを高レベルで受け取った細胞を濃縮します。目的の細胞の限界希釈条件を最適化した後、プレートは細胞を96ウェルプレートに選別し、1ウェルあたり100マイクロリットルの細胞培養培地でプレートあたり30細胞を希釈しました。残りの選別されたバルクセルについては、将来のめっきのためにセルの半分を凍結します。

残りの半分をスクリーニングとプライマーバリデーションのためにプレートします。これらのバルク細胞を摂氏37度で3〜7日間インキュベートします。クローンを摂氏37度で7〜14日間インキュベートします(細胞株の倍加時間にもよりますが)。

ゲノムDNAのResusを単離するために使用され、DNA抽出液の50マイクロリットルで親およびバルク細胞ペレットを懸濁します。サンプルをサーモサイクラーで分析し、ゲノムDNAを抽出します。次に、DNA濃度を測定します。

次に、2つのXPCR混合物の10マイクロリットルを組み合わせて、20マイクロリットルのPCR反応を組み立てます。0.5マイクロリットルの10マイクロモルフォワードプライマー、0.5マイクロリットルの10マイクロモルリバースプライマー、50〜100ナノグラムのゲノムDNAと最大20マイクロリットルの水。非欠失型バンドと欠失型バンドのPCRを別々の反応で実施します。

次に、サンプルをサーモサイクラーに入れ、添付の書面によるプロトコルに詳述されているように、Aニーリング温度が摂氏60度で35サイクルを使用して実行します。1つのXTAEバッファーを使用して、2%アロスゲル上のサンプルを10ボルト/センチメートルで分離します。次に、サンプルに非欠失バンドと欠失バンドの有無を調べます。

欠失と非欠失のPCRプライマーペアを1回の反応でマルチプレックス化する戦略を考えてみましょう。あるいは、欠失PCR反応と非欠失PCR反応を別々に実行することもできます。浮遊細胞の場合、すべてのクローンを、ウェルあたり50マイクロリットルの細胞培養培地がすでに含まれている単一の96ウェルプレートに移します。

次に、各ウェルから50マイクロリットルを96ウェルPCRプレートに移します。あるいは、接着細胞については、トリプシン、眼、クローンを単一の96ウェルプレートに移す前に。次いで、各ウェルから50マイクロリットルを96ウェルPCRプレートに移し、PCRプレートをGの400倍で5分間遠心分離し、PCRプレートをシンク上でフリックして上清を除去する。

次に、ウェルあたり50マイクロリットルのDNA抽出溶液を追加し、ゲノムDNA抽出後に細胞ペレットを再懸濁し、PCR反応を実行してクローンからの非欠失および欠失バンドを検出します。PCR産物を2%arosゲル上で10ボルト/センチメートルで分離します。1 つの XTAE バッファーを使用します。

目的の欠失があるクローンを同定し、より大きなプレートまたはフラスコで培養物を増幅します。この例では、左から右に、3つの非欠失クローン、3つのモノアレル欠失クローン、および3つのバイアレル欠失クローンを観察しています。オーバーラップしない複数のSG r NNAペアを使用すると、オフターゲット効果の制御に役立つ場合があります。

各ペアは、一意の欠失の生成につながります。遺伝子に対して様々な位置のSGペアを標的とするブレークポイントを使用して、遺伝子本体全体を消去してフレームシフトインデルを作製し、一方または両方の対立遺伝子が欠失していなくても、または特定のアイソフォームの破壊を可能にすることができる。この実験では。

全遺伝子の欠失については、PIM one two SG RNAペアをPX3 3 0発現ベクターにクローニングして設計し、エレクトロポレーションによりMEL細胞に送達した。GFPレポーターとともに、上位3%のGFP陽性細胞を限定欠失時にクローン的にプレーティングし、このPIM1欠失の非欠失モノアレルおよびバイオアレル欠失クローンについてPCRによってスクリーニングしました。バイオ対立遺伝子欠失クローンは、増殖に5日間経過した後、さらなる増殖のために選択されました。

各クローンをゲノムDNAのPCRによって再試験し、BICの欠失と欠失を確認しました。Ampliconsは、正確な欠失を特定するためにサンガーシーケンシングにかけられました。BIC欠失クローンからRNAを単離し、R-T-Q-P-C-Rで解析してPIMの1つの発現の喪失を確認しました。

この手法を習得すれば、数週間で完了し、生命欠失クローンを同定することができます。このビデオを見れば、CRISPR CAS 9ヌクレアーゼシステムを使用して、CRISPRプラスミドのポアリング、GFPブライトセルの選別、および従来のPCRによるBioE欠失クローンの個々のクローンのスクリーニングにより、ゲノム欠失を作成する方法を十分に理解できるはずです。