文化と共培養マウスの卵巣と卵胞
2015年3月17日
このプロトコルは、新生児マウスと思春期前のマウスからの個々の卵胞から卵巣を使って、マウスの卵巣組織の初代培養/共培養を説明しています。培養技術は、卵巣上の外因性薬剤の効果の研究を可能にする、高度に生理的な方法で開発を支援し、卵胞の間の相互作用の。
この手順の全体的な目標は、新生児の卵巣や個々の卵巣卵胞をin vitroで成長させることです。これは、最初に適切な年齢の冷たい女性から卵巣を解剖することによって達成されます。2番目のステップは、鍼治療針による個々の卵巣卵胞の細かい解剖を含む組織を準備することです。
次に、新生児卵巣または個々の前胞状卵胞を定期的な摂食で培養し、最後のステップは、組織学的または分子学的分析のために組織を固定または凍結することです。最終的に、培養システムは高度に生理学的な方法で発生をサポートし、卵巣卵胞の発達の調節を調べたり、原始卵胞と成長卵胞との間の相互作用を調査したりするために使用できます。この技術の主な利点は、無傷の卵巣卵胞が卵胞の発達を通じて支持され、支持マトリックスを必要とせずにそれらの三次元構造を維持することです。
この方法は、卵巣生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ち、化学療法、薬物などの有毒化合物が卵巣、ひいては女性の生殖能力に及ぼす影響を調査するのにも役立ちます。私たちは最初に、休息している原始卵胞プールに成長する卵胞の影響を調査する方法を議論するときに、異なる年齢、したがって卵巣卵胞の段階を共培養するというアイデアを持っていました、ステフ・モーガンとリサ・キャンベルと一緒に技術を実演するのは、研究所の技術者であるビビアン・アリソンと、長年研究室のポスドク科学者であったアリソン・マレーです。どちらも、このプロトコルのピペットを引っ張る技術の重要な側面の開発を支援しました。
ガラスピペットを炎で加熱して曲げ、ガラスカッターを使用してきれいにカットします。その後、湾曲したガラスを摂氏160度で約45分間滅菌します。ピペットで自分のテクニックに適したカーブを描くには練習が必要です。
ピペットは常にガラスカッターでカットして、ガラスがギザギザにならないようにしてください。また、組織に適した直径のエンドを持っていることを確認したい 0.2ミクロンのフィルターを介してBSAでレボウィッツL 15培地で作られた解剖培地を滅菌するために構築されています。これは、新生児の卵巣培養物を滅菌するために作られた直径25ミリメートルです。
直径わずか25mmの別の0.2ミクロンフィルターにミディアムを通し、滅菌チューブに集めます。次に、新生児用培地1ミリリットルを24の各ウェルに加えます。ウェルプレートをプレート化し、各ウェルの培地の表面にメンブレンを移します。
卵胞培養培地も卵巣培養培地と同様にフィルター滅菌されています。次に、シリコンオイルもフィルター滅菌する必要があります。次に、96ウェル培養プレートを、一番上の列に沿って30マイクロリットルの卵胞培地で修復します。
これらのウェルを70マイクロリットルのシリコンオイルで慎重に覆います。あるいは、卵胞卵胞共培養には、100マイクロリットルのシリコンオイルを重ね合わせた100マイクロリットルの培地が必要です。次に、ウェルあたり1ミリリットルの培地と非常に慎重に配置されたUV滅菌された核po膜を使用して、卵胞卵巣共培養プレートを準備します。
まず、1ミリリットルの解剖培地を各滅菌ガラス胚皿に移します。生後0〜5日の子犬に着色した後、腹壁を覆う皮膚を細かい鉗子でつかみ、皮膚と体壁を切開します。腹部が露出しているこの大きな切開部を引き開きます。
膀胱は通常、この段階で充血し、解剖を容易にするために穿刺することができます。時計メーカーの鉗子を使用して、内臓を脇に動かします。次に、両側で、膀胱から腎臓まで子宮角をたどります。
卵巣は、子宮の上部にある腎臓のすぐ下にある雲のような構造です。ハサミを使って卵巣を優しくつかみます。子宮から切り取ります。
両方の卵巣を解剖した後、温かい解剖で満たされた皿に移します。中程度。37°Cに加熱したステージを備えた解剖顕微鏡を使用して、インスリン針を使用して卵巣を解剖します。基底袋と卵管を含む余分な材料を切り取り、卵巣だけが残るまで切り取ります。
次に、湾曲したピペットを使用して、準備したプレートのウェルに各卵巣を移します。各膜培養物に1つの卵巣を置き、培地を交換するときは、組織が1日おきに培地の半分を最大6日間交換します 膜を乱さないように、ピペットチップを培地のウェルの端に置きます。培養後、卵巣は凍結または固定または組織学または免疫化学で保存することができます。
温かみ解剖培地の皿に高齢マウスから卵巣を採取した後、卵巣バサを取り出します。インスリン針を使用して、基底嚢と卵管を含む余分な物質を切り取り、卵巣だけが残るまでします。次に、針を使用して卵巣を半分に切り、各半分を1ミリリットルの解剖培地が入った個々の時計グラスに慎重に移します。
時計のグラスをスライドガラスで覆い、できるだけ早くオーブンで最大1時間保管します。薄層流フード内の加熱ステージを備えた顕微鏡下で作業し、インスリン針を使用して卵巣を大きな断片に解剖し、後期前卵胞を特定します。前肛門卵胞には、2〜3層の肉芽腫細胞が含まれており、直径は約180〜200マイクロメートルです。
インライン針とニードルホルダーで固定された鍼を使用してこれらのいずれかを解剖し、基底椎弓板の損傷を避けますが、周囲のS間質を必ず取り除いてください。これには練習が必要です。卵胞には糞便組織が必要ですが、多すぎてはいけません。
また、解剖プロセスが荒すぎると、卵胞が損傷し、破裂または死にます。培養中、ユーザーは卵胞を新しい培地で満たされた時計ガラスに慎重に移す準備をしました。解剖顕微鏡に取り付けられた校正済みの接眼レンズを使用して、卵胞をパーペットの細い口径部分に保ちます。
卵胞を測定します。直径 190 マイクロメートルから 10 マイクロメートル以内の場合。それらは培養に使用されるかもしれません、選択された卵胞から他の卵胞を捨てます。
培養に最も健康的なものだけを選んでください。それらは半透明で、暗い網状領域がなく、無傷の基底層流といくつかの付着した髄膜組織がある必要があります。良好な収量は、卵巣あたり10〜15個の卵胞です。
次に、準備した湾曲したパープを使用して、これらの卵胞を準備した96ウェル培養プレートに移します。油層と培養物の下の各ウェルに1つの卵胞を置きます。卵胞は毎日最大6日間です。
メディアを含む新しい行を準備します。1時間以上後、卵胞を新鮮な平衡培地の次の列に移すか、卵胞卵胞共同培養物2つの卵胞を1つに並べて培養します。さて、移す代わりに、細いジェルチップを使用して、1日おきに培地の半分を交換してください。
卵胞卵巣の場合、共培養は卵胞を培養プレートの膜上に置かれた新生児卵巣に移し、卵胞を新生児卵巣の一方の極のそばに注意深く置き、それらが互いに接触するように移動できるようにします。このカルチャを最大 5 日間維持します。一日おきに500マイクロリットルの媒体を交換します。
前胸部卵胞は、しばしば新生児卵巣によってカプセル化されます。この培養中に、新生児の卵巣を6日間培養し、生殖毒物に曝露しました。培養の2日目に、組織を処理して、卵胞のさまざまな段階の数と健康状態を決定しました。
調査された毒物の1つはシスプラチンでした。調査された他の毒物はドキソルビシンでした。別の実験では、ゴナドトロピン卵胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモンが個々の卵胞の成長に及ぼす影響を調査しました。
しかし、この分析では、卵胞のサイズを定期的に測定して、その成長をマッピングしました。卵胞卵胞共培養は、A GFP発現卵胞および野生型卵胞突起が一方から他方に広がることを用いて調査した。この共培養物の免疫組織化学的処理により、GFPプロセスが野生型に存在することが明らかになりました。
髄腔層である野生型新生児卵巣も、GFP発現卵胞と共培養した。このシナリオでは、GFPプロセスは卵巣間質を介して移動しました。新生児卵巣培養は非常に簡単な方法ですが、損傷を受けていない無傷の胞状卵胞前を解剖する技術を習得するのに時間がかかることを期待してください。
これは、彼らの適切な開発に不可欠です。卵胞培養に続いて、卵子は体外受精によって受精することができ、その後、胚を偽妊娠女性に移し、生きた若さを得ることができます。
概要
このプロトコルは、新生子と発育前マウスの卵巣組織の原代培養と共培養について概説し、新生子の卵巣と個々の卵巣卵胞を利用しています。使用される技術は生理学的発達を促進し、卵巣に影響を与える外因子と卵巣卵胞間の相互作用の研究を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生殖生物学
- 細胞培養技術
背景
- この研究は、新生子の卵巣と卵巣卵胞のin vitroでの成長に焦点を当てています。
- 支持マトリックスなしで卵巣卵胞の三次元構造を維持することを目指しています。
- この方法により、卵巣卵胞の発達と相互作用の調査が可能になります。
- また、卵巣の健康と女性の生殖能力に対する有毒物質の影響を評価することもできます。
研究の目的
- 卵巣卵胞の発達の制御を調査すること。
- 原始卵胞と成長中の卵巣卵胞の間の相互作用を探ること。
- 外部物質が卵巣組織に与える影響を評価すること。
使用された方法
- 新生子と発育前のマウスからの卵巣の解剖。
- 特殊な針を用いた個々の卵巣卵胞の微細解剖。
- 定期的な培地交換を伴う卵巣組織の培養。
- 組織の固定または凍結、その後の組織学的または分子生物学的分析のため。
主要な結果
- この培養システムは卵巣組織の生理学的発達をサポートします。
- 完全な卵巣卵胞は培養中にその構造を維持します。
- この技術は卵巣生物学と生殖能力に関する洞察を提供します。
- 卵巣の健康に対する様々な化合物の効果の研究を促進します。
結論
- このプロトコルは卵巣生物学を研究するための貴重なツールです。
- 卵胞の相互作用と発達の検討を可能にします。
- この方法は女性の生殖能力に関する重要な疑問に答える助けになります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This ovarian culture system enables physiologically relevant in vitro modeling of follicle development and intercellular interactions, supporting target validation in reproductive toxicology and fertility research. By maintaining intact three-dimensional follicle architecture without extracellular matrices, the method provides a disease-relevant system for assessing compound effects on ovarian reserve and oocyte quality. The co-culture design facilitates mechanistic de-risking by elucidating paracrine signaling between primordial and growing follicle populations, informing early-stage safety profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying follicle progression from primordial to preovulatory stages under compound exposure.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of oocyte maturation and fertilization competence in vitro.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by modeling ovarian responses to gonadotropins and cytotoxic agents like cisplatin and doxorubicin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by sustaining physiological follicle growth and structural integrity.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through defined culture media, silicon oil overlays, and regular medium exchange protocols.
- Scientific Value: Highlights screening readiness via quantifiable outputs such as follicle diameter measurements (180–200 μm for preantral stages) and health scoring based on translucency and basal lamina integrity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling human ovarian follicle dynamics in a murine system, enabling translational biomarker alignment for fertility endpoints.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by supporting follicle culture up to six days for ovaries and five days for co-cultures.
- Scientific Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by identifying toxicant-induced follicle depletion or damage histologically or molecularly.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing of ovarian toxicants and pathway clarification of follicle activation mechanisms.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing via exposure to compounds like cisplatin and doxorubicin, and pathway clarification through GFP-expressing follicle co-culture showing intercellular process migration.
- Screening: Describes assay readiness through follicle isolation using acupuncture needles, culture in filtered Leibovitz L-15 medium with BSA, and silicon oil overlays to prevent evaporation.
- Analytics: Highlights measurements such as follicle diameter tracking (within 10 μm of 190 μm target) and health assessment based on morphology and attached thecal tissue for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling oocyte retrieval post-culture for in vitro fertilization and embryo transfer to pseudo-pregnant females.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through cryopreservation or fixation of cultured tissues for repeated histological and molecular analysis across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in follicle-compound interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via defined dissection, culture, and co-culture protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in fertility-focused programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on ovarian follicle health and oocyte quality readouts.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microsurgical dissection using insulin and acupuncture needles to isolate intact preantral follicles.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including dissected microscopes with heated stages, laminar flow hoods, glass pipette pullers, and 0.2 μm filtration systems.
- Cross-team standardization requirements for medium preparation (Leibovitz L-15 + BSA), silicon oil overlays, and membrane-based co-culture setups.
- Adaptation considerations across model systems, noting the protocol’s optimization for neonatal (P0–P5) mouse ovaries and individual follicles.
- Practical limitations supported by source material: proficiency-dependent follicle isolation to avoid rupture or death, and time-intensive mastery of pipette curving and tissue handling.
