腸神経系のその場のCa ²⁺イメージングに

腸内神経系(ENS)は、腸壁に位置するニューロンとグリアのネットワークで、腸の反射を制御します。このプロトコルは、Ca²⁺イメージングを使用してENSのライブ調製物中の腸管ニューロンおよびグリアの活動を記録する方法を説明しています。

この手順の全体的な目標は、蛍光カルシウムインジケーター色素を使用して、腸のライブホールマウント調製物中の腸内ニューロンとグリアの活動を画像化することです。これは、最初に動物から腸の一部を切り取り、それを予温培地に入れることによって達成されます。2番目のステップは、腸間膜境界に沿って腸を開き、粘膜表面を上に向けて軽い張力で平らに固定することです。

筋腸神経叢の全マウント調製物は、マイクロダイセクションによって調製され、イメージング皿に入れられます。次に、全体のマウント調製物に蛍光指示薬Dye flu oh fourをインキュベーターにロードします。最終ステップでは、ロードされた調製物は、画像取得および分析ソフトウェアによって制御される高解像度カメラを備えた蛍光イメージング顕微鏡を使用して画像化され、ベースラインアクティビティを記録します。

次に、調査中の薬物を添加し、ニューロンとグリアのカルシウム過渡性を記録します。最終的にはその場で。腸管神経系のカルシウムイメージングは、ニューロンとグリアの細胞活動が腸の生理学的機能および腸の病態生理学における腸内神経系機能障害の調節にどのように寄与するかを研究するために使用されます。

この技術の意味は、神経細胞と腸グリアとの間の複雑な相互作用を調べるためのシンプルで堅牢な方法を使用して、機能性腸疾患と炎症性腸疾患の生理学と病態生理学の理解を確立することにまで及びます。NC 2カルシウムイメージングは、この手順を実証しています 私の研究室の科学者には無料で提供されます。実験動物からの組織を含む以下の手順は、動物の安楽死に関するA VMAガイドライン2013と一致しており、承認された手順に従って動物を安楽死させた後、動物を仰臥位に置き、70%エタノールで腹部の上の皮膚をきれいにします。鉗子を使用して腹部の皮膚を正中線でつまみ、次に手術用ハサミを使用して線形肘に沿って6センチメートルの内側切開を行い、内部の消化器官を露出させます。

次に、鈍い鉗子を使用して、腹膜内の結腸を見つけて露出させます。回腸腸間膜をハサミで切り、腸を解きほぐし始めます。腸の長さが十分に解けたら、盲腸の遠位と直腸の近位にある結腸を切断して、このビデオで示される大腸の準備を行います。

次に、腸セグメントを迅速に除去し、3マイクロモルの塩酸ニカルジピンと1つのマイクロモルのSスコポラミン塩酸塩を添加したDM EMF 12培地を含むビーカーに氷上に置きます。これらの阻害剤の追加は、腸の平滑筋を麻痺させることにより、マイクロダイセクションとその後のイメージングを容易にします。所望の腸セグメントの小さな4〜6センチメートルのセグメントを取り出し、冷やしたサプリメント培地で満たされたシルガードコーティングされたペトリ皿に入れる。

次に、腸セグメントの近位端と遠位端を昆虫ピンで固定し、腸間膜の境界に沿って縦方向にまっすぐに切り込んで腸管を開きます。次に、粘膜を上にして軽い張力で組織を平らに固定し、5番の細い鉗子で粘膜を持ち上げ、非常に細かいスプリングハサミで下を切って、粘膜層を慎重に解剖します。組織を約0.5cm四方の小さな製剤に切断し、各ピースをサプリメント培地で満たされたイメージング皿に入れ、氷上に置きます。

各準備物を四隅に固定し、円形の筋肉層を上に向けて固定します。細いピンセットで輪状筋をからかって慎重に解剖します。筋腸神経叢を露出させるには、過度のストレッチを避け、イメージング皿を氷の上に戻し、各皿の溶液を新鮮なサプリメント培地と交換します。

次に、皿を氷から取り出し、各皿に2ミリリットルの酵素混合物を加え、5%の二酸化炭素と95%の空気と室温で15分間インキュベートします。最後に、組織調製物を培地で3回洗浄し、限られた光の条件下で作業しながら角を抑制し、1.5ミリリットルのサプリメント培地と1.2マイクロリットルの250ミリモルプロビットストックから1.5マイクロリットルの4ミリモルフルオロ4ストックまでの光退色を防ぎます約1.5ミリリットルのインフルエンザoh 4ローディング溶液でイメージング皿に、37°Cの暗いインキュベーターで45分間インキュベートします議事録。インキュベーターから皿を取り出した後、調製物を培地で3回洗浄します。

次に、200マイクロモルのプロップ酸を含む新しい培地を添加して神経ニューロンの標識を強化し、前と同じように15分間インキュベートします。インキュベーション中に、プロトコルの書かれた部分の指示に従って修飾クレブス緩衝液を作成し、筋肉の収縮を阻害するために3マイクロモルのニカルジピンと1つのマイクロモルのスコポラミンを追加します。カルシウム2プラスイメージングおよびホールマウント解剖では、記録チャンバーを蛍光顕微鏡下に配置し、複数の加熱シリンジリザーバーを備えた重力流灌流システムを使用します。

摂氏37度のクレブス緩衝液の毎分2〜3ミリリットルの連続灌流速度を確立します。バキュームトラップに接続された入力ラインと吸引ラインの両方で気泡が形成されないようにしてください。明視野照明下で目的の神経叢に焦点を合わせます。

光退色につながる可能性のある組織を露出しすぎないようにしてください。神経節内のインフルエンザoh 4負荷を調べ、イメージングのために健康な神経節を選択します。不健康な損傷を受けた神経節は、自家蛍光または点状の形態を示すため、イメージングには使用しないでください。

ガングリオンを選択したら、光路をカメラに向け、ライブ画像を取得します。画像取得ソフトウェアを使用して、神経節に焦点が合っていることを確認し、画像取得速度と露光時間を設定します 画像取得速度と時間は、研究者が記録したいイベントによって異なります。ほとんどの実験では、従来、グリア細胞では0.5〜1ヘルツ、最大2〜10ヘルツで画像を取得します。

ニューロンの場合、グリアカルシウム一過性はカルシウム一過性ニューロンほど速くないため、 記録を開始し、実験刺激がない場合で選択した神経節のベースライン生理学的活動を30秒間確立します。次に、レセプターアゴニストやアンタゴニストなどの関心のあるプレウォーミングドラッグを、ドラッグに最適化されたプロトコルに従って、毎分2〜3ミリリットルの速度で重力フロー灌流システムを使用して適用します。録画を停止し、実験のタイムラプス動画をご覧ください。

適切な画像解析ソフトウェアを使用して、関心領域またはROIを慎重に選択します。最後に、適切なイメージングソフトウェアを使用して、関心領域の蛍光強度を正規化し、その初期ベースラインと比較します 正規化された蛍光の値の変化は、カルシウムの変化に正比例します。次の3つの画像は、モルモットの腸溶性グリアがその場でTPに反応することを示しています。

基礎条件下では、破線で囲まれた低レベルのフルオロ4蛍光が見えます。矢印は、1リットルあたり100マイクロモーのTPグリア細胞で刺激すると、太い神経節間線維路を指していますが、ニューロンはカルシウムの増加を示す蛍光4蛍光を急速に増加させません。応答する細胞は小さく、アスタリスクでマークされた暗い空間で示されるはるかに大きなニューロンを取り囲んでいることに注意してください。

このヒストグラムは、腸内グリアが用量依存的にTPに反応し、1リットルあたり1ミリモルが最大の反応を引き出すことを示しています。このビデオは、マウスの遠位結腸からの筋腸神経節を示しており、カルシウム2プラスインジケーター染料インフルエンザOH4がロードされています。グリア細胞アゴニストであるDPは、必要に応じて浴に加えられます。

DPは、インフルエンザoh 4蛍光の一時的な上昇によって観察されるように、腸内グリアの細胞内カルシウムの2プラスの増加を誘発します。このビデオを見れば、ニューロン間の複雑な相互作用を正確に調べる方法と、カルシウムイメージングを使用して経験的に調べる方法について十分に理解できるはずです。ホールマウント調製物におけるカルシウム応答のメカニズムと潜在的な機能的影響を特徴付けるには、理想的なイメージング品質のための正確な解剖が必要です。

この顕微鏡ベースの技術で蛍光標識と薬理学的刺激を使用することで、これらの細胞の天然の多細胞環境における評価を向上させることができます。