Name: 幼虫活性の測定ショウジョウバエアクティビティモニタ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の活動測定法。TriKinetics DAM装置を用いて赤外線ビームで個別の動きを検出し、遺伝的背景による行動変化を客観的かつ自動的に解析できます。神経科学と遺伝学研究に有用です。

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幼虫の調製<ol><li>移動や位置の好みのための所望の幼虫を分析するために、標準的なフライ食品11を使用して10を分析したい年齢に標準的な条件下で幼虫を育てます。 </li><li>漏斗の上にシルクスクリーングレードのナイロンメッシュを延伸してメッシュフィルタを作成します。ゴムバンド付きファンネルネックでメッシュを固定します。ビーカーに漏斗を配置します。 </li><li>分析のための幼虫を収集するには、へらフル培養瓶から採餌幼虫を含有する食品のスクープと絵筆10とメッシュから直接個々の幼虫を収集し、メッシュフィルター上でRTの水道水で洗います。 </li></ol>アッセイチューブの調製<ol><li>アッセイチューブを接続するために準備するために、慎重に4％寒天ゲルを沸騰さ1.5センチの深さにシャーレに注ぎます。動物が封入されている場合に、チューブの両側のためのプラグインを提供します。 4％溶液は、pから幼虫を防止するために十分に密ですプラグをenetrating。 </li><li>チューブは前幼虫の挿入にクリーンでクリアされていることを確認してください。そうでない場合、これは記録されないような動きを阻止することができます。 </li><li>幼虫が移動するのに十分な水分を持っていることを確認するために、少量のお湯を含むスクイーズボトルを準備します。シンクに向かう出口を向けると、撮像管から水を排出するために静かに絞る慎重に、ボトルを反転。 </li><li>アッセイチューブにボトルの出口を挿入します。結露の薄い層がチューブの壁に表示さ​​れるまで、アッセイチューブに水蒸気を提供するために、ボトルを絞ります。ビデオ1は、水分の適切な量のチューブに移動する幼虫を示しています。 </li><li>チューブ内の幼虫を密封するために、ペトリ皿から1.5センチメートル厚い寒天ゲルを除去し、寒天プラグをチューブの中に挿入することができるように、寒天の下に空気の流れを可能にするために、メッシュ表面の上に置きます。一方の端部にゲルの2つのプラグを挿入するために、二回ゲルにアッセイチューブの一方の端を押してください。 </li><li> paintbとラッシュ、約1.5インチの深さのチューブに1幼虫を置き、寒天ゲル内に幼虫に最も近い端部を押してチューブをシール。得られた圧力は反対側の端部からの寒天ゲルの第2のプラグを強制し、チューブ内に動物をシールします。 </li><li>プレイスMB5マルチビームショウジョウバエアクティビティモニタ（DAM）装置で、チューブ、および動物がセンサーの範囲を超えて移動できないように、チューブのポジションを調整します。 </li><li>そのアッセイチューブは、輸送中にデバイスの赤外線読み取り枠の外にスライドさせないようにするには、それが接触する記録装置を各チューブの周りにパテのリングを固定することにより、所定の位置にチューブを保持します。 </li></ol> 3.測定アクティビティ<ol><li>インキュベータ内のレコード活性は、影、蛍光灯やラボ内の温度変化に発生することがあり、不正確な読み取りを防止します。システムの推奨構成については、図5を参照してください。 </li><li> 20°C（ 図1参照）にインキュベーターを設定します。記録時に白熱光源からの干渉による誤記録を回避するために、蛍光インキュベーターライトをオフにし、インキュベーター内で記録しながら個別のLED光源を使用しています。光の状態が異常にセンサーを誘発しないことを確実にするために、任意の動物なしで裁判を行います。この試験の後に記録された運動データがあってはなりません。 </li><li>幼虫は、アッセイ開始前の5分間20℃のインキュベーターの設定に順応することができます。 </li><li>所望の記録間隔（ 例えば、1分）にDAMシステムを設定するには、DAMシステムレコーディングソフトウェアをコンピュータ12をホストし、PSIUインターフェイスに記録チャンバーを接続する前にDAMシステム·ファイルを開くためにダウンロードされることを確認します。 </li><li> 、データが保存される時に所望の記録周波数を設定し、選択優先し、次にそのデータを様々な時間枠を選択するための読書間隔オプションの上または下をクリックし保存されます。例えば、1時間に1秒からインターバル時間を読んで選択します。 </li><li> 、データの記録に変化するパラメータを選択するプリファレンスを選択し、出力データタイプの下に対応するボックスを選択するには（カウント、移動、位置と住む、表1を参照）。各パラメータは、チューブ内の幼虫の活動のユニークな分析を提供します。 </li><li>録音を開始するには、CAB6の電話ケーブルを使用して電源インタフェースユニット（PSIU）にモニタを接続します。電源コンセントにPSIUを接続します。緑色のライトは、適切な接続を示します。 </li><li>データ記録用のMacintoshまたはWindows PCにUSB（Universal Serial Bus）ケーブルを介してPSIUを接続します。自動的にデータの記録を開始するには、コンピュータのDAM SystemMB1v6xプログラムを開きます。 </li><li>所望の収集時間が完了すると、終了を選択し、その後DAMアクティビティ画面に現在終了。データは、自動的にDAMシステムデータで保存されます。このデータファイル（ 例えば 、1を監視）し、ドラッグしてください<html>別のフォルダに。彼らは、後で処理できるようにこれは、DAMのソフトウェアからの生データを格納します。 </li></ol>処理のためのデータの準備4.（DAMファイルスキャン） <ol><li>理解しやすい形式に生データを処理するには、DAMファイルスキャンアプリケーションを開き、選択入力データフォルダを選択します。そして、データフォルダー、目的のファイルを選択して、スキャンオプションを選択します。最後に、所望の読み出し期間にビンの長さを選択します。これは、オペレータが設定したパラメータに生データを整理しますと、プログラムは、その特定の範囲内で収集されたデータを報告します。 </li><li>所望の動作設定（モニターの数、移動、住む）を分析するために、出力データ型を選択します。追加の測定値メニューの下で、ビンに選択合計（これはビンの長さが選択したシステムの読み取り間隔よりも大きい場合）。 </li><li>適切にファイルに名前を付けて保存します。ファイルには、ステップ3.9からのフォルダと同じ場所に保存されます。 </li></ol>_title &quot;&gt; 5。分析のためのデータへのアクセス<ol><li>以前に保存したファイル（ステップ4.3）を開き、平均移動、プロセススプレッドシートプログラムでテーブルを生成するには、手順4から生成された生データを収集するために、テキストインポートウィザード]ウィンドウが表示されたら、[完了]を選択し、開くためには、スプレッドシート形式のデータファイル。 注：分析されたデータの種類に応じて、スプレッドシートは、異なって読み出されます。各個別の読書チューブが指定手紙を受け取ることになりますしながら、典型的には、モニタを移動または数を測定するために、研究の期間は、数値的に記録されます。スプレッドシートのデータを表示すると、列はそれぞれ、アッセイチューブ1〜16用のスロットを表すKZ。行は、収集されたデータ点を表します。 </li><li>移動は、1分間隔で20分間採取した場合、例えば、移動/分、他の測定値の平均値を計算するために20行を平均します。 </li></ol>

<ol><li>Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila.gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila.gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+mechanisms+controlling+the+timing+of+larval+developmental+and+behavioral+transitions+require+the+Drosophila.DEG%2FENaC+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Pickpocket1.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit.</a> Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila.+melanogaster.and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila.larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae.</a> J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila.+hordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants.</a> PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).</li>
<li>Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J. Vis. Exp. (61), (2012).</li>
<li>Godoy-Herrera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+genetics+of+digging+behavior+in+Drosophila.+arvae%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae.</a> Heredity. 56, 33-41 (1986).</li>
<li>Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+throughput+assays+of+locomotor+dysfunction+in+Drosophila.+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).</li>
<li>Homyk, T., Sheppard, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Isolation+and+mapping+of+mutations+which+decrease+flight+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability.</a> Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).</li>
<li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila.+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae.</a> J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).</li>
<li>Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans">https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans</a> (2015).</li>
<li>Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+spontaneous+locomotor+activity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).</li>
<li>Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+larval+movement+patterns+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The development of larval movement patterns in Drosophila).</a> Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+the+locomotor+activity+in+Drosophila.+melanogaster.and+its+mutants+%E2%80%98sine+oculis%E2%80%99+and+%E2%80%98small+optic+lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>Johnson, A. W., Carder, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+ociceptors+mediate+larval+aversion+to+dry+surface+environments+utilizing+both+the+painless+TRP+channel+and+the+DEG%2FENaC+subunit%2C+PPK1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1.</a> PLoS ONE. 7 (3), (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ショウジョウバエ幼虫の活性は遺伝子型8、13歳、周囲温度2を含む様々な要因によって影響されます。非常に詳細な分析が可能な強力なビデオグラフィック方法は歩行5を研究者たちによって開発されているが、このレベルの詳細は、活動の基本的なパラメータを決定したい人のための余分な場合があります。ここで説明する方法は、多くの研究室で利用可能で、デバイスを採用し、操作が簡単であり、再現性の高い結果を生成し、さらにその一次調査の焦点移動はないもののために管理可能です。例の結果は、このアッセイは、異なる温度（ 図1）と異なる遺伝子型（ 図2）に付し幼虫における運動性に有意な変化を検出するために用いることができることを実証します。 それらの、35°C - 幼虫を5°Cの範囲の温度で測定したときに活性は、20°Cと25°C（ 図1）との間の傾向の中断を除いて、温度とともに増加しました。これは、採餌早期3齢幼虫は、典型的な...

遺伝的ツールとしてのショウジョウバエの使用は、生物学的システムの科学的知識を変革しました。ショウジョウバエの幼虫は、侵害受容1、発生2、およびヒト疾患遺伝子の研究3のモデルとして、さまざまな研究で使用されてきました。ショウジョウバエの活動は、温度2、薬物への曝露4、および異なる遺伝子型間を含む、さまざまな条件下で変化するさまざまな行動を包含しています。しかし、モデル生物として幼虫が大量に利用されているにもかかわらず、幼虫の活動を分析するための簡単で標準化された方法は利用されていませんでした。現在、多くの幼虫の運動研究では、高度なビデオ解析ソフトウェア5が採用されています。このような自動化ツールは強力ですが、その複雑さは、ロコモーションを研究する設備がまだ整っていない研究室が、有益な活動パラメータの分析を研究に含めることを躊躇させる可能性があります。グリッドクローリング分析などの他の現在の非自動化方法では、動きは人間の観察者によって採点されるため、主観性の可能性が生じ、スループットを一度に1匹に制限します6-7。同様の研究では、幼虫が特定の直線距離を移動するのにかかる時間を測定する5レーンのクロールアッセイを使用した8。このような非自動アッセイでは、変位が測定されますが、これは開始点と終了点の間の非線形移動を考慮していません。以下で説明するように、ここで説明する方法は、実際の幼虫の動きをより多く説明し、客観的で操作が簡単で、堅牢なスループットを提供します。
精度、効率、またはコストを損なうことなく、幼虫の活動行動を簡単に研究するために、この方法は、成虫の活動を研究するためによく使用される装置であるTriKineticsショウジョウバエ活動モニター（DAM）を採用しています。1つの装置を使用して成虫と幼虫の両方の活動を研究することは費用対効果が高く、これら2つのライフステージでの動物の動きを直接比較することができます。このシステムは、メーカーの最高レベルの分解能を特長とし、アッセイチューブあたり17本の赤外線検出ビームを利用し、16本の個々のチューブ内でセンサービームが切断されたときに幼虫の活動を記録します。その後、記録した情報をコンピュータに自動的に保存し、基本的なグラフ作成ソフトウェアで操作できるようにします。得られたデータは、個々の幼虫によって破壊されたビーム(速度に変換可能)、幼虫が検出器ビーム内に留まったときの動き、および記録期間中のアッセイチャンバー内の動物の位置(位置選好を計算可能)を表しています。このシステムは効率的で操作が比較的簡単で、ショウジョウバエの幼虫を研究するあらゆる研究室の手の届くところに再現性の高い基本的な活動分析をもたらします。
このアッセイの威力を示すために、周囲温度の変化による活性の違いを検証するためのその使用を示すデータ、および以前に低活性と記載された変異体(iav1)9と広く分析された対照(w1118)との比較を通じて提示されます。

<table><tbody><tr><td>ショウジョウバエ活動モニター、マルチビーム、16本のチューブ、ワイヤーを含む</td><td>TriKinetics Inc.&nbsp;</td><td>MB5</td><td></td></tr><tr><td>アクティビティモニタ用電源インタフェース&nbsp;</td><td>TriKinetics株式会社&nbsp;</td><td>PSIU24</td><td></td></tr><tr><td>アクティビティモニター用ガラス製80×5mmチューブ (100)</td><td>TriKinetics Inc.&nbsp;</td>Macintonsh OSX (Intel)用<td>PGT 5x80</td><td></td></tr><tr><td>DAMsystemMB1v6xデータ収集ソフトウェア</td><td><a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a></td><td></td><td>無料ダウンロード</td></tr><tr><td>DAMFileScan 108xソフトウェア</td><td>(Macintosh用)<a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a></td><td></td><td>無料ダウンロード</td></tr><tr><td>USBソフトウェア(PSIUdrivers.zip)。</td><td><a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a></td><td></td><td>無料ダウンロード</td></tr><tr><td>DAMSystem Notes 308</td><td><a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a></td><td></td><td>無料ダウンロード</td></tr><tr><td>ツァイスステミ 2000C- 実体顕微鏡</td><td>スペクトルサービス</td><td>SP-STEMI2000C-BS</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素</td><td>メイン オキシ</td><td></td><td>麻酔</td></tr>フライ<tr><td>パッド</td><td>ジェネ</td><td>シー59-114</td><td>麻酔をかけたハエを選別するための表面</td></tr><tr><td>小さなペイントブラシ&nbsp;</td><td>ウィンザー&ニュートン</td><td>#2 ROUND</td><td>または類似の、麻酔されたハエを選別するために使用される</td></tr><tr><td>シルクスクリーン印刷メッシュ (160)</td><td>msj-gallery.com</td> このプロトコルで使用された<td>SM160W63-3YD</td><td>の孔のサイズは~0.1 mm</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee</td><td>20-258</td>防<td>腐剤</td></tr><tr><td>エタノール(190proof)</td><td>Pharmco</td><td>111000190</td><td>Tegosept</td></tr><tr><td>6オンススクエアボトムボトル(PP)</td><td>Genesee</td>を溶解するために使用されました<td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックフライボトル用「フラッグ」</td><td>ジェネシー</td><td>49-100</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアル、ワイド (PS)</td><td>ジェネシー</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>ワイドプラスチックバイアル用フラッグ</td><td>ジェネシー</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>イエロー 脱ゲルメン コーンミール</td><td>金メダル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ寒天</td><td>培地ラボサイエンティフィック</td><td>フライ 8020</td><td></td></tr><tr><td>パン屋の酵母 - レッドスター</td><td>キングアーサー粉</td><td>1270</td><td></td></tr><tr><td>グラニュー糖 - エクストラファイン</td><td>ドミノ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

ショウジョウバエの幼虫は多くの行動研究で使用されていますが、幼虫の活動の基本的なパラメータを測定するための簡単な装置は利用されていません。このプロトコルは、成虫の活動を測定するためによく使用される機器、TriKinetics Drosophila活動モニター(MB5 Multi-Beam Activity Monitor)を再利用して、幼虫の活動を研究します。この装置は、16本の8cmガラス製アッセイチューブ内の動物の動きを、1本あたり17本の赤外線検出ビームを使用して監視することができます。ロギングソフトウェアは、データをコンピューターに自動的に保存し、移動回数、センサーがトリガーされた時間、チューブ内の動物の位置などのパラメーターを記録します。その後、データを分析して、全体的な移動運動や位置の好み、およびその他の測定値を表すことができます。すべてのデータは簡単にアクセスでき、基本的なグラフ作成およびデータ操作ソフトウェアと互換性があります。このプロトコルでは、装置の使用方法、ソフトウェアの操作方法、および幼虫活動アッセイの開始から終了までの実行方法について説明します。

図1は、7つの異なる温度での幼虫の運動の違いを検出するための監視装置を使用し、1118ワット、制御3齢幼虫の温度応答試験の結果を示します。幼虫を洗浄し、上記のようにDAM活動装置に入れ、所望の温度に設定したインキュベーターに入れました。記録が開始される前に装置を5分間環境に順応させました。各幼虫を個別に20分間かけて移動するために分析し、毎分移動の平均数は、すべての動物について計算し、32匹の動物の各セットについて平均しました。データを分析し、表計算プログラムを使用してグラフ化しました。温度は20℃と25℃でのこのような傾向の中断を除いて、5度刻みで5〜35°Cからそれに対応して増加すると幼虫が大幅上昇活性を示しました。 違いはCOUていることを確認するにはLDを制御し、以前に低活動として記載の変異体との間で検出され、 非アクティブな幼虫（IAV 1）を試験しました。データは、32匹の動物のそれぞれについて、移動/分として分析し、平均値を計算しました。 図2</stro...

このレポートは、TriKinetics Drosophila Activity Monitorを使用してショウジョウバエの幼虫の活動を測定する方法について説明しています。このデバイスは、赤外線ビームを使用して、最大16匹の個々の動物の動きを検出します。データを分析して、アッセイチャンバー内の動物の速度や位置などの運動パラメータを表すことができます。

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

本手順の全体的な目的は、複雑なビデオ解析ソフトウェアを使用せずに幼虫の活動性を分析することです。まず、選別した幼虫をメッシュフィルターに移し、ゴミなどの不純物を洗浄して取り除きます。次に、個々の幼虫をアッセイチューブに移し、オーガープラグで固定します。このチューブをショウジョウバエ活動モニター（DAMデバイス）に挿入して解析を行います。3〜5分間の順化の後、解析のためにDAMシステムから記録を取得します。最終的に、DAMで測定された幼虫の移動を用いて、特定の遺伝子型におけるさまざまな活動パラメータを解析できます。この手法が既存の方法よりも優れている点の一つは、自動化されており客観的であることです。日常的な活動量の測定に十分な簡便さを備えているだけでなく、多くの研究室では、幼虫への適用に容易に転用可能な必要設備をすでに保有しています。本手順の実演は、私の研究室の学部生であるAiden McFarlinが行います。本プロトコルでは、M fiveマルチビームショウジョウバエ活動モニター装置（DAM）を使用します。ダムをセットアップします。まず、CAB 6 電話ケーブルを使用して、モニターを電源供給インターフェースユニット（PSIU）に接続します。次に、PSIUを電源コンセントに接続します。適切な接続が完了すると、緑色のライトが点灯します。次に、データ記録のため、PSIUをUSBケーブルでコンピュータに接続します。これで、コンピュータにDAMシステムMB one V six Xプログラムをインストールして起動してください。ソフトウェアを開くと、ソフトウェアコントロール内でデータの記録が自動的に開始されます。記録間隔を任意に設定してください。「Preferences」を選択し、「reading interval」オプションの上または下をクリックして、データを保存する異なる時間枠を選択します。「環境設定」および「出力データ形式」の下で設定可能なその他のパラメータが多数あります。各パラメータによって、チューブ内における幼虫の活動について独自の解析が行われます。データ収集を開始する前に、すべてのパラメータを選択しておくことを推奨します。本アッセイでどのパラメータを測定すべきか判断できない場合は、アッセイ予定の各遺伝子型について、採餌行動を示す幼虫を入れたバイアルを準備してください。アッセイチューブの調製には、標準的な環境およびフライフードを使用します。シャーレに4%オーガー溶液を深さ1.5 centimetersまで注ぎます。これにより、アッセイチューブのプラグ材となり、生物が穴を掘って進入できないほどの密度になります。次に、チューブを温水で洗浄し、汚れがなく詰まっていないことを確認してください。続いて、100 millilitersの水が入ったスクイズボトルを電子レンジで

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ショウジョウバエにおけるストレス誘発性うつ様状態の多様行動表現型

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幼虫活性の測定

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