の血液細胞集団のアッセイキイロショウジョウバエ幼虫

この手順の全体的な目標は、単一のショウジョウバエの幼虫から循環および常在する血液細胞集団を分離し、定量化することです。これは、最初に、幼虫の体壁の定義された切開部を通じて、循環する彼の細胞を穏やかに出血させることによって達成されます。2番目のステップは、幼虫の表皮と筋肉層の間にある造血ポケットから常在する血液細胞の集団を解放することですが、これには針やその他の解剖ツールを使用してこすったり、ジャブしたりする必要があります。

幼虫の死骸に残っている血球をカウントし、放出された血液細胞を幼虫が解剖したスライドガラス上に画像化します。最後のステップは、放出された血液細胞を定量化するためにImage J分析を実行することです。これにより、幼虫あたりの循環血球数と常在血球数の計算が可能になり、たとえば、異なる発生段階の幼虫を比較することができます。

フルーツフライトロザラメロン。オーガスタは、免疫と血球発生の一般原則を理解するための優れたモデルです。血液細胞や無脊椎動物はヘモとも呼ばれ、一般的に血リンパ液中を循環していると考えられています。

しかし、多くの発達段階や成人では、ヘモソットの大部分は、実際には特定の組織に常在するセシルクラスターに見られます。最近の研究は、これらの常在性血液集団、それらの特性および調節に焦点を当てており、我々は、ショウジョウバエの幼虫から常在および循環血液細胞を選択的に分離することを可能にする方法を開発しました。この方法は、循環する集団と常在する集団を区別し、それらの分離と定量化に対する自動化された再現性のあるアプローチを提供します。

この方法は、ショウジョウバエの幼虫の造血ポケットに常在する血液細胞の研究を開始したときに開発されました。私たちは、レジデントヘモソットと循環ヘモソトを選択的に分離すると、これら2つの集団は増殖などで異なる行動を示すことを発見しました。この方法の視覚的なデモンストレーションは、循環血液細胞内のレジデントの位置とそれらを選択的に放出する方法に精通することが重要であるため、役立ちます。

この方法は、例えば、血液細胞を誘導し、それらの造血ポケットへの局在を促進するシグナル、またはその逆に関する、発生、造血および免疫における重要な問題に対処することを可能にする。セシルの血液を循環に動員するシグナルに関して、例えば、免疫チャレンジの後、この方法に不慣れな個人は、幼虫を優しく扱い、この手順の出血部分を正確に切開するのに苦労するかもしれません。これらの手順は、2 つの集団が混ざり合って同時に放出されないようにするために重要です。

この方法は、さまざまなサイズのショウジョウバエや星のショウジョウバエに非常に役立ち、他の発達段階や他の無脊椎動物にも適応できる可能性があります。フライフードから幼虫を隔離するには、バイアルに水を噴射し、幼虫をペトリ皿に流します。ペイントブラシを使用してペトリ皿から幼虫を選び、空洞皿のような水に入れます。

幼虫を冷たい金属ブロックのスライドに移し、蛍光顕微鏡で目的のサイズと遺伝子型の幼虫を選択します。幼虫は、蛍光タンパク質または別の目に見える細胞マーカーの発現によって細胞をマークする導入遺伝子を運ぶ必要があります。1匹の幼虫を最初のパップペンに入れます。

さて、循環している彼の細胞を分離するために、解剖、はさみ、または2本のきれいな針を使用して、幼虫の腹側に切開を行います。常駐を避けるために、彼は幼虫の後端に1つの切開部、前端に1つの切開部をサイト化します。切開が各幼虫の同じ場所に行われることを確認します。

幼虫が圧力や物理的な動揺なしに数秒間出血するのを待ちます。数秒後、針または鉗子で幼虫をそっと持ち上げ、2番目に置きます。まあ、彼がサイトする居住者を解放するためにすすぐために。

幼虫を次の井戸にそっと移し、幼虫を1本の針先で固定します。別の針を使用して、幼虫の体壁を通して見える彼の細胞のクラスターを分割します。居住者を解放するときはリンパ腺を避けてください。

彼は細胞を動かします。幼虫の一部を選択して各ウェルに突っ込み、残りのサンプルについても同じことを行います。最終的なカーカスを同じスライドのきれいな領域に置き、できるだけ薄く広げて、光学層に最大限に焦点を合わせます。

残りの数をカウントします 彼はタリーカウンターを使用して手動でサイトします。解剖が完了したら、細胞が落ち着くまで5〜15分の重量を量ります。イメージングの前に、ウェルはスライドを乾燥を避けるために湿ったチャンバーに保管します。

スライド上に沈殿したhe細胞を蛍光顕微鏡で調べ、沈殿したhe細胞の蛍光画像をシングルウェル法で撮影します。イメージングフィールドは、タイルスキャン方法の全体をしっかりとカバーする必要があります。ウェルの縁を選択し、市販の顕微鏡を使用して画像を取得します。

その後、タイルスキャンソフトウェアで得られた画像を解析し、ヘモサイト定量化を行います。Image Jソフトウェアが起動し、ウェルイメージが開きます。イメージが 8 ビットまたは 16 ビットであることを確認します。

画像を選択してしきい値を調整します。次に、[調整] と [しきい値] を選択します。しきい値ウィンドウを観察するには、暗い背景オプションを確認し、赤を選択します。

次に、下限しきい値レベルを調整します。この設定により、ユーザーはセルを赤い点でマークできます。覆われていないセルはグレースケールで表示されます。

粒子分析装置を起動して細胞をカウントし、選択、分析し、粒子の分析をクリックします。オーバーレイアウトラインを選択して、アルゴリズムカウントを確認し、細胞番号を分析し、OKをクリックして、カウントレジデントで概要ウィンドウを観察すると、彼は細胞が機械的に乱される可能性があり、循環血液細胞の人口が一時的に増加して乱れを達成します。幼虫全体をガラスビーズで渦巻かせ、一定期間回復させ、その間に細胞が造血ポケットに移動します。

これは、攪乱の前後に循環する血液細胞の割合を定量化することにより示され、回復期間後に常在する血液細胞を機械的に攪乱し、最大4〜8匹の幼虫を選択し、約0.5グラムの600ミクロンガラスビーズと0.5ミリリットルの水を含む2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。チューブを手で渦巻かせ、1分間10の速度で渦巻きます。マイクロ遠心チューブの内容物をペトリ皿にこぼし、ペイントブラシで幼虫を取り出して、ガラスビーズから幼虫を回収します。

フライフードの薄い層で事前に準備したペトリ皿に幼虫を置きます。幼虫を45分間インキュベートして、回復期間後に幼虫が血球パターンを再確立できるようにします。コントロール幼虫で前述したように出血擦り傷解剖を続けると、ヘモサイトは造血ポケットに局在し、側方パッチと背側縞を形成します。

幼虫の一時的な機械的障害は、常在する血液細胞を犠牲にして、循環する血液細胞の人口の劇的な増加につながります。回復期間の後、彼は細胞を造血ポケットに戻ります。幼虫は、背側血管に関連するクラスターと背側縞が拡大することがあり、これらは擾乱後の早期蓄積の主な部位です。

評価された循環血球の割合は、ブリードスクレイプ法を使用して定量化されました。この方法は、無脊椎動物の血液細胞研究に新たなアプローチを提供します。これにより、住民の自己再生血液細胞やその他の血球の集団を調査して、局所的な微小環境や全身の手がかりによる調節を理解することができます。

このビデオを見た後、常在するヘモインスタル幼虫の循環を選択的に分離および定量する方法をよく理解しているはずです 一度習得すると、この技術は幼虫あたり約15分で完了することができます。これには、血球の放出イメージングと定量化が含まれます。この手順に続いて、免疫化学や細胞生物学的アッセイなどの他の方法を実行して、血球の増殖、分化、生存、食作用の状態などの問題に対処できます。

この手順を試みるときは、落ち着いて循環する血液細胞を放出し、幼虫を優しく扱い、循環する血液細胞と一緒に常在する血液細胞を放出しないようにすることが重要です。