咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

ここでは、心臓と筋肉の前駆細胞とその微小環境の生物学を研究するための咽頭弓の培養プロトコルを提示します。

この手順の全体的な目標は、咽頭中胚葉の心臓と筋肉の前駆細胞の維持、移動、および運命を研究することです。これは、最初に採取したばかりのマウス胚から咽頭弓を解剖することによって達成されます。次に、アーチは、それらの取り付けを容易にするために、メディアのフィルムに配置されます。

その後、咽頭エクスプラン内または咽頭エクスプランから移動する細胞を毎日監視します。最終的には、Creeベースの蛍光系統追跡を使用して、咽頭弓内の心臓および筋肉前駆細胞の移動分化と再生を追跡できます。この手法の主な利点は、心筋前駆細胞の新たな集団とその微小環境をin vitroで研究するための唯一のex vivoシステムであることです。

9.5日齢のマウス胚の親弓のサイズはわずか2〜300マイクロメートルであり、事前の視覚化なしには同定および解剖が非常に困難であるため、この方法のデモンストレーションは非常に重要です。手順を開始する前に。Coda 12、PBSを10%FBSで補ったウェルプレート。

1時間後、コーティング溶液をウェルあたり200マイクロリットルの無血清培地と交換します。プレートを渦巻かせて、ミディアムのフィルムがウェル底の表面全体を覆っていることを確認します。次に、安楽死させた妊娠中のマウスの腹に70%エタノールをスプレーして洗浄します。

次に、滅菌ツールを使用して、海軍領域で0.5センチメートルの切開を行います。切開部の上下の皮膚をつかみ、反対方向にそっと引っ張ります。次に、腹部の両側のへそから卵巣までの膜にV字型の切開を行い、子宮を明らかにします。

子宮と卵巣をつなぐ卵管を鉗子でつまみ、卵巣側の卵管をハサミでつまんで子宮を卵巣から解放します。子宮を優しく引き上げます。子宮を膀胱領域から解放します。

次に、子宮をUCTでさらに引き上げ、反対側のUCTを切断して、子宮を腹腔から解放します。カルシウムとマグネシウムを含む20ミリリットルの冷たく滅菌されたPBSを含む50ミリリットルのチューブに子宮を移します。チューブを10秒間静かに振って血液を洗い流します。

次に、鉗子を使用して子宮を10ミリリットルの皿に移し、組織に5ミリリットルの冷たいPBSを追加します。次に、実体顕微鏡で、2対の鉗子を使用して子宮を静かに開き、胚を含む羊膜袋を一度に1つずつ解剖します。次に、各胚について、一方の鉗子のペアで羊膜袋をつまんでそっと取り出し、もう一方のペアを使用して袋を切断して胚から解放します。

胚を横向きに置き、鉗子を使用して、アーチと咽頭嚢の間の心臓の後方にある第1弓と第2弓を切断します。胚をひっくり返して反対側のアーチを切った後、ちょうど実演されています。アーチと胚をつなぐ心臓流出路を切断し、それらを除去します。

残りの心臓流出路と4つの腸内胚葉から、2つの咽頭弓のそれぞれをつまんで解放します。次に、アーチが培地で覆われないように注意しながら、コーティングされた12ウェルプレートの個々のウェルの中央に組織を移します。接着を容易にするために、細胞培養条件下でアーチをインキュベートします。

2時間後、200マイクロリットルの摂氏37度、無血清培地をウェルの側面に加え、アーチが付着したままで組織を一晩インキュベートするように注意します。翌日、アーチがまだ取り付けられていることを視覚的に確認しました。次に、さらに200マイクロリットルの37°Cの血清を含まない培地をウェルに静かに加えます。

組織が付着しなくなり、浮き始めた場合は、アーチを取らずにピペットで培地を静かに取り除き、培地のフィルムだけが残るまで取り出します。次に、ピペットの先端を使用してアーチをウェルの中央に戻し、組織を再度インキュベートします。2日おきに、蒸発した培地を100〜200マイクロリットルの新鮮な培地と交換します。

顔面筋と心臓の前駆細胞は、増殖して第1咽頭弓と第2咽頭弓から移動し、それぞれ頭筋と心筋組織になるときに追跡できます。咽頭弓を培養することで、心臓と筋肉の発達を生体外で詳細に研究するユニークな方法が得られます。CREロックシステムを使用すると、マウス中胚葉の子孫は、36〜72時間でex vivo培養から24〜48時間以内にCreeの発現時に蛍光レポーターによって追跡できます。

心筋細胞の形成は、第2弓内の遊走細胞のクラスターを自発的に収縮させること、および特定の心筋細胞マーカーの分析によって視覚的に確認することができます。培養の3〜7日後、筋管および顔面筋の形成は、第1のアーチ内で細長い自発的に痙攣する細胞として視覚化することができ、特定の筋肉マーカーの分析により、その発生後に観察することができる。この技術は、心臓および筋肉幹細胞生物学の分野の研究者が、拡大する前駆細胞とそのニッチをin vitroで直接監視および研究する道を開きました。

このビデオを見た後、発達中のマウス胚から有孔弓を解剖する方法と、生体外で心臓と筋肉の生殖発達の研究を可能にするin vitroでの文化的方法についてよく理解できるはずです。