後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

このビデオ記事は、膵管腺癌における後根神経節(DRG)/癌細胞モデルの使用を示しています。

このモデルの全体的な目標は、癌性の神経微小環境を再現することです。これにより、がん細胞のニューロン相互作用の探索が可能になります。この方法は、腫瘍細胞とニューロン間の相互作用や各セットの相互影響など、腫瘍微小環境分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、信頼性が高く、実行が容易で、神経ニッチの細胞因子と脳因子の両方に対処することです。この技術の意味するところは、がんの発症全体にわたる神経リモデリングと浸潤プロセスにおける主要因子の治療法開発と薬理学的標的化にまで及びます。動物をCO2チャンバーで安楽死させた後、毛皮を70%エタノールに浸し、乾燥させます。

マウスを腹臥位に固定し、後頸部から腰椎まで頭蓋尾側に伸びる正中線切開を行います。次に、鉗子を使用して真皮フラップを両側に持ち上げ、皮下組織を露出させます。頭蓋頸部接合部が特定されるまで、マウスの頭蓋骨を触診します。

動物に対して垂直に角度をつけたハサミを使用して、頭蓋頸部接合部で頸部の筋肉と脊椎を切り裂きます。次に、脊椎を尾側に解剖し、ハサミを使用して5番目の腰椎で完全な尾側離反を行います。次に、マウスを仰臥位に置き、首から腹部にかけて正中線に沿って切開した後、皮膚を横方向に引っ込めてから腹膜を切り開きます。

頭蓋骨で胸壁をハサミで開きます。腹膜器官と後腹膜器官を切除した後、鉗子と手術用刃を使用して肋骨を切断し、脊柱から約5mmの肋骨が突き出たままになります。体の他の部分から脊柱を取り除きます。

冷たいPBSで2回洗います。脊椎を同じ頭蓋尾の向きで上向きに非接着性の吸収プラットフォームに置き、4倍の倍率を備えた実体顕微鏡で観察します。この実体顕微鏡を覗きながら、脊髄の筋肉と結合組織をすべて取り除きます。

肋骨は、脊椎を離れる神経の目印として使用します。DRGは、頸椎、胸椎、腰椎にあります。はさみを使用して正中線で椎体を切断し、脊髄への窓を作り、次に椎体をゆっくりと引っ込めて脊髄とDRGの根を露出させます。

次にスプリングハサミを使って上肋骨を取り外し、DRGを露出させます。末梢神経をDRGの外側の肋骨に沿って内側に追従します。神経の上に横たわっている目玉焼きの卵黄のように見えると説明できるDRGを特定します。

DRGの遠位の肋間神経を切断し、神経節の遠位の神経の2〜3ミリメートルを収縮に使用します。鉗子を使用して遠心性神経を慎重につかみ、DRGを挟んだり損傷したりしないようにします。次に、神経を横方向に引っ張ることにより、DRGに穏やかな引っ込みを加えます。

次に、DRGの近くで前根と後根を切ります。分離されたDRGを、氷冷したサプリメントDMEMで満たされた35ミリメートルのシャーレに移します。層流フードで作業し、35ミリメートルのガラス底のペトリ皿を氷上の紙のグリッドに置きます。

予冷したピペットチップを使用して、グリッドの中央に約10マイクロリットルの成長因子が枯渇したECMを分注します。2〜4倍の倍率で実体顕微鏡で皿を見ながら、DRGをECMの中央、皿の底近くに置きます。コンフルエント培養物から目的の40, 000個のがん細胞を採取して洗浄した後、ペレットと40マイクロリットルのECMを氷上に再懸濁します。

もう一度、実体顕微鏡でグリッドを表示し、DRGから500ミクロンを測定し、この時点で10マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。DRGからすべての方向で繰り返します。皿を層流フードに10〜15分間置いて固めますが、乾かないようにします。

ECMが固まったら、プレートの側壁にピペッティングして、補充したDMEMをゆっくりと加えます。ECMを覆うのに十分な約2ミリリットルのメディアを追加します。DMEMの添加は、DRGがプレートの底部から剥がれないように、プレートの側壁に対してピペッティングして非常にゆっくりと行う必要があります。

プレートを組織培養インキュベーターにセットし、プロトコールの書かれた部分の指示に従って培養を維持します。この顕微鏡写真は、播種後0日目の視野の上部にDRG、視野の下部にがん細胞を示しています。ここでは、播種から7日後に同じ培養が示されています。

矢印で示されているように、がん細胞はDRGニューロンに沿って移動します。このヒストグラムは、さまざまな種類のがん細胞のDRG神経浸潤指数を示しています。Kpc 989細胞やMiaPaCa細胞は、QLL2細胞やNIH3T3細胞よりも神経浸潤指数が高いことが分かります。

この座標グラフは、神経と接触しているKpcがん細胞の移動経路を赤で、QLL2細胞を紫で示したものです。X 座標と Y 座標が表示されます。この図は、軸索接触を伴うQLL2がん細胞の移動について、起点距離からの分析を示しています。

ここでは、Kpcがん細胞の起源の距離を示しています。いずれの場合も、移動の方向は神経節に向かっていました。この手順を試みている間、チェック率が100%ではないため、必要以上に神経節を準備することを覚えておくことが重要です開発後、DRGの動機は、癌研究の分野の研究者が腫瘍微小環境内の神経ニッチを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、マウスのDRGなどの解剖学的ランドマークを認識する方法、DRGを抽出する方法、そして最後にDCMで培養する方法を十分に理解できるはずです。DRGとがん細胞の共培養も提示されます。