HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

HIV感染時には、ウイルスに感染した細胞によって、ウイルスとエクソソームと呼ばれる微小胞の両方が産生されます。この手順の全体的な目標は、HIV感染患者の血漿サンプル中のウイルス粒子からエキソソームを分離することです。この方法は、HIV感染中に産生されるエクソソームにどのようなタンパク質や分子が存在するかなど、エキソソーム分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手順を実演するのは、微生物学、生化学、免疫学部門のインストラクターであり、ここムーアハウス医学部のHIV / AIDSグループのメンバーであるMing Bo Huang博士です。ヒトの血液を採取し、テキストプロトコルに従って血漿を単離した後、15ミリリットルのチューブ内の10ミリリットルの血漿に10ミリリットルの1X PBSを加えます。サンプルを 10, 000 倍 G と摂氏 4 度で 30 分間遠心分離し、セルラーの破片を除去します。

滅菌血清学的ピペットを使用して、透明化した血漿上清を清潔な25ミリリットルの超遠心チューブに移します。次に、透明化した血漿をGの200,000倍、摂氏4度で2時間遠心分離し、大きな小胞を分離します。次に、上澄みを慎重に取り除き、バイオハザード廃棄物に捨てます。

1ミリリットルの1X PBSを使用して、ペレットを再懸濁し、室温で30分間インキュベートし、穏やかに渦巻いて粒子を分離します。25ミリリットルの超遠心チューブに再懸濁したばかりのエキソソームウイルス溶液に24ミリリットルのPBSを加え、チューブを5回dinphurして混合します。次に、200,000倍のGと摂氏4度で再び回転させてから、バイオハザード廃棄物のPBS洗浄液を廃棄します。

ヨージキサノールの6〜18%の速度勾配を調製するには、ヨージキサノール試薬の60%ストック溶液から始めて、1X PBSを使用して6%と18%に希釈しますスターラーをオンにし、デュアルチャンバーグラジエントメーカーに、18%溶液の5.5ミリリットルを攪拌チャンバーに、5.5ミリリットルの6%溶液をリザーバーチャンバーにピペットで移します。次に、ストップコックを開き、ポンプをオンにして、各溶液を14ミリリットルの超遠心チューブに流します。次に、1ミリリットルのエキソソームウイルス溶液を各11ミリリットルの勾配の上部に慎重に重ねます。

次に、SW 40 Tiスイングバケットローターを使用して、Gの250,000倍、摂氏4度の勾配を2時間遠心分離します。その間に、1.5ミリリットルの微量遠心チューブを12本ラベル付けします。スピン後、グラジエントの上部から1ミリリットルを取り出し、チューブ番号1に移します。

次に、残りの1ミリリットルのフラクションを2〜12のチューブに順番に移します。1X PBSを100部、基質を2部、カラーインジケーターを5部混合してアッセイ試薬を作製します。次に、12個の1ミリリットルのグラジエントフラクションのそれぞれを複製して50マイクロリットルを96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移します。

まず、PBSで2, 000ミリユニット/ミリリットルのACHEストック溶液を作成して、一連の標準を準備します。次に、ストックの11回の2倍連続希釈を行い、96ウェルマイクロタイタープレートの1つのウェルに2,000ミリユニット/ミリリットルから始まる各希釈の50マイクロリットルを追加します。標準試料およびグラジエント画分の各ウェルに200マイクロリットルのアッセイ試薬混合物を加え、プレートリーダーで20分間インキュベートして発色します。

最後に、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルの波長でACHE活性を測定します。テキストプロトコルに従って追加のアッセイを実施します。ここに示すように、ACHE活性によって同定された単離されたエキソソームは、ヨージキサノール勾配の上部で低密度画分1〜3に分離され、HIV抗原P24によって同定されたウイルス粒子は、高密度画分10〜12に分離されました。

この表は、マルチプレックスアッセイを使用した21種類のサイトカインおよびケモカインのエキソソームおよび未分画血漿の分析を示しています。ここに示されているように、21のサイトカインとケモカインはすべてHIV-1陽性の個人のエキソソームで検出され、それらのレベルはHIV-1ゼロワンネガティブコントロールの血漿およびエキソソームと比較して有意に上昇しました。この図では、非感染ドナーからの末梢血単核細胞またはPBMCSが、HIV-1陽性または陰性の個人からのプールされたエクソソームに曝露されました。

曝露後48時間までに、ナイーブおよびセントラルメモリーのCD4陽性およびCD8陽性のt細胞の表面にある活性化マークCD38のレベルは、HIV陰性治療と比較してHIV-1陽性エキソソームに曝露された場合に有意に上昇しました。アセチルコリンエステラーゼアッセイでは、プレートを強い光から遮蔽することを忘れないようにすることが重要です。この技術は、HIV/AIDSの研究者がHIV感染と免疫活性化におけるエクソソームの役割を探求する道を開きました。