腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。

この手順の全体的な目標は、初代ヒト神経膠芽腫細胞における侵襲性移動行動を観察および分析することです。この方法は、疾患の進行や治療反応における患者固有の違いの根底にある表現型および分子特性は何かなど、神経腫瘍学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、膠芽腫のin vivo組織構造と細胞の不均一性を維持しながら、初代細胞を直接操作できることです。

まず、滅菌鉗子を使用して、ウェルごとに1ミリリットルのスライス培養維持培地を含む6ウェルプレートの各ウェルに空のPTFE培養インサートを配置します。すべてのインサートを追加したら、プレートを摂氏37度、CO2濃度5%の加湿ウォータージャケット組織培養インキュベーターに入れます。次に、腫瘍組織片を氷冷処理培地の入ったシャーレに入れ、ピペットを使用して組織を新鮮な培地で3回優しく洗浄し、付着した赤血球を取り除きます。

3回目の洗浄後、メスを使用して腫瘍片を約3 x 3 x 10ミリメートルのストリップに切断し、付着した血管を慎重に取り除き、壊死組織や焼灼組織を避けます。すべての組織をトリミングしたら、摂氏37度の液体アガロースを5〜7ミリメートルの2立方体のプラスチック埋め込み型に加え、氷のベッドでアガロースを1分間冷やします。長軸を垂直に向け、2〜4本の組織をアガロースに置き、組織を配置してからさらに2〜5分間氷上に置きます。

アガロースが固まった状態で、型枠の側面をメスで切り取り、型からアガロースをそっと取り出します。そして、シアノアクリレート接着剤をたっぷりと垂らして、アガロースブロックをビブラトーム試料プレートに固定します。接着剤が固まったら、アガロースブロックを氷冷処理媒体に沈め、トリミングされた滅菌プラスチックピペットを使用して、5%CO2、95%O2の混合物をビブラトームリザーバー内の媒体に泡立てます。

ビブラトームスライスの厚さを300〜350ミクロンに設定し、組織の一貫性とビブラトームの仕様に応じてブレードの前進速度とブレードの振幅を調整します。計画された実験分析に従って、ステンレス鋼のマイクロスパチュラを使用して、スライスを取得したら氷冷処理媒体を含むシャーレに移し、適切な数のスライスを取得します。すべてのスライスを取得したら、マイクロスパチュラを使用して各スライスを1つのPTFEインサートに移します。

12〜24時間のインキュベーション後、新鮮なスライス培養維持培地を含む新しい6ウェルプレートを細胞培養インキュベーターで15分間平衡化します。次に、滅菌鉗子を使用して各インサートを縁でつかみ、インサートを新しい6ウェルプレートの個々のウェルに移します。7〜10日間の培養で、5〜10マイクロリットルのGFP発現レトロウイルスを各組織スライスの表面にゆっくりと滴下し、プレートをインキュベーターに戻します。

信号が明らかな場合は、ガラス底の皿に1ミリリットルの新鮮なスライス培地を平衡化し、滅菌鉗子を使用してインサートを皿に移します。ディッシュを共焦点顕微鏡の37度、5%CO2密閉顕微鏡ステージトップインキュベーターに入れます。10倍の長い作動距離の空気対物レンズと単一または多光子イメージングを組み合わせて、細胞移動の3次元時間分解画像をキャプチャします。

顕微鏡でスライスを視覚化し、スライスの端と組織の中心との間に蛍光標識腫瘍細胞が適切な密度で適切なフィールドを見つけます。次に、イメージングソフトウェアの多次元解析モードで、イメージングするすべての位置に可視の蛍光細胞シグナルが含まれるようにZスタックの中心を設定し、各Zスタックの取得に適切な時間を設定します。まず、ImageJ で Z スタック ファイルを開き、[イメージ]、[スタック]、[Z プロジェクト] を選択します。

解析のために Z スタックの最初と最後のタイム フレームを選択し、投影タイプとして[最大強度]を選択して、最大強度投影または MIP レンダリングを生成します。系列の各時点の MIP を一度に生成するには、[すべての時間枠] チェックボックスをオンにします。画像化された各領域でキャプチャされた Z スタック イメージの各セットから MIP を作成します。

PluginsメニューからMTrackJを開き、Addボタンをクリックします。目的の腫瘍細胞の細胞体重心を手動で特定するには、細胞の視覚的に近似した中心点をクリックします。一連の画像の各時間枠でセル本体の位置を区切って、各セルに固有のトラックを作成し、次のセルのセル本体の位置を順番にマークします。

特定の腫瘍微小領域で細胞の集団が追跡されたら、測定機能を使用してすべての細胞追跡座標をエクスポートし、後で分析するためにファイルをxls形式で保存します。最後に、細胞の移動経路に沿った各ポイントに記録された座標を使用して、腫瘍浸潤の定量的分析を実行します。器官型膠芽腫のスライスは、培養全体を通じて、最大15日間の偽パリサダー壊死およびミクログリアの維持を含む、元の腫瘍組織との一致を示しています。

低酸素条件下では、スライスは迅速な生理学的応答を開始し、血管内皮増殖因子の培地への放出を誘導します。このプロセスは、生体内の神経膠芽腫微小環境内で豊富に発生します。GFP発現腫瘍細胞のタイムラプス画像を定量的に測定することで、サンプル中の腫瘍領域における膠芽腫細胞の移動速度と方向性を計算できます。スライス培養内のミクログリアにおける混ざり合っているが形態学的に異なる運動性腫瘍細胞の移動を追跡すると、細胞タイプ特異的な運動パターンが明らかになります。

スライス領域を約10分ごとにイメージングすることで、細胞分裂中の腫瘍細胞のタイムラプス画像を記録するための適切な時間分解能も得られます。たとえば、これは、移動を一時停止し、有糸分裂を完了し、娘細胞で遅延なく移動を再開したときに捕捉された分裂細胞のペアです。これらはすべて 3 時間以内に行われます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば90分で完了できます。