脱アセチル化アッセイは、サーチュインの間にInterplay（SIRT2）と特異的なタンパク質 - 基質を解明します

このプロトコールの全体的な目標は、サーチュインの特異的脱アセチル化基質としてのタンパク質の役割を確立するために、in vitroおよびin vivoの脱アセチル化アッセイを実行することです。アセチル化されていることが判明するタンパク質の数が増えているにもかかわらず、アセチル化が広く存在していると主張していますが、これらの修飾を調節する特定の酵素は、これらのタンパク質のほとんどでまだ特定されていません。これらのアッセイの主な利点は、タンパク質を特定の脱アセチル化酵素の正当な基質として確立することにより、脱アセチル化酵素の新たな役割と機能を解明できることです。

この方法は、サーチュイン2特異的基質の同定に関する洞察を得ることができますが、わずかな変更を加えることで、サーチュインファミリーの他のメンバーにも適用できます。この手順を開始するには、HEK 293 T細胞を8ミリリットルのDMEMに10 cm培養皿に、10%FBSを抗生物質に溶かして、細胞が一晩成長した後に約70%コンフルエントになるようにします。翌日、GFPおよびFLAGタグ付きSIRT2を発現する4マイクログラムのレンチベクター、4マイクログラムのパッケージングベクター、および0.5マイクログラムのエンベロープベクターで細胞をコトランスフェクションします。

DNA1マイクログラムあたり3マイクロリットルのPEIの比率でポリエチレンイミンまたはPEIを使用します。トランスフェクションの12時間後に培地を交換します。36〜48時間後に上清を回収します。

1, 000 gで摂氏4度で5分間遠心分離することにより、破片を除去します。0.22マイクロメートルのフィルターでろ過した後、SIRT2レンチウイルスの1ミリリットルのアリコートを作成し、摂氏マイナス80度で保存します。細胞に感染する準備ができたら、SIRT2レンチウイルスを氷上で解凍します。

ポリブレン1ミリリットルあたり8マイクログラムの存在下で、80〜90%コンフルエントなHEK293T細胞の6ウェルプレートに1ミリリットルのレンチウイルスを感染させます。ウイルスに感染した細胞を摂氏37度のインキュベーターに24時間置きます。24時間後、メディアを交換します。

感染から48時間後、蛍光顕微鏡でGFP陽性細胞を検出し、感染効率を確認します。感染効率が少なくとも40〜50%の場合は、培地をピュロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む培地に交換して、安定したSIRT2過剰発現細胞を選択します。細胞をインキュベーターに戻します。

安定なSIRT2過剰発現細胞の選択には約2週間かかり、培地は3〜4日ごとに交換する必要があります。SIRT2の精製には、FLAG SIRT2を発現するHEK 293 T細胞の10cm皿を少なくとも10枚調製します。24時間後、培地を取り出し、PBSで細胞を2回洗浄し、トリプシン処理により細胞を収集し、続いて1,000gで摂氏4度で10分間遠心分離します。

プロテアーゼ阻害剤カクテルと非クラス3ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるTSAの1マイクロモルを含むディッシュあたり500マイクロリットルの溶解緩衝液Aで細胞ペレットを溶解します。一定の回転下で摂氏4度で30分間インキュベートします。30分後、摂氏4度で15分間14, 000gで遠心分離します。

上清を新しいチューブに移します。アガロースビーズに結合した抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行います。200〜300マイクロリットルの抗FLAG抗体をタンパク質溶解物に加え、摂氏4度で一晩絶えず攪拌しながらインキュベートします。

翌日、1, 000 gおよび摂氏4度で5分間遠心分離することにより免疫沈降物を回収する。5回目の洗浄後、上清を除去し、プロテアーゼ阻害剤カクテルとTSAを含む1つのX FLAGペプチド溶液をアガロースビーズに加えます。摂氏4度で、一定の回転下で30分間インキュベートします。

上清を6, 000 gで遠心分離し、摂氏4度で2分間収集します。フィルターチューブを使用し、摂氏4度で15, 000gで1分間遠心分離することにより、上清からアガロースビーズを除去します。最後に、限外ろ過メンブレンを使用して、溶出したサンプルを、最終的なタンパク質濃度が1マイクロリットルあたり1マイクログラムになるまで濃縮します。

精製したSIRT2はマイナス80°Cに保ちます。この手順は、HEK 293 T細胞の10 cm培養皿を10個調製することから始め、翌日には約70%のコンフルエントになります。翌日、タンパク質基質を発現する5マイクログラムのFLAGタグ付き血漿感染体と、タンパク質をアセチル化できる特異的アセチルトランスフェラーゼ5マイクログラムで細胞をコトランスフェクトします。

特定のアセチルトランスフェラーゼが不明な場合は、既知のヒストンアセチルトランスフェラーゼの混合物を使用してください。.DNA1マイクログラムあたり3マイクロリットルのPEIの比率でPEIを使用してください。トランスフェクションした細胞を12時間インキュベートします。

その後、培地を交換し、細胞を24時間インキュベートします。培養培地をTSAとニコチンアミドを含む培地に交換することにより、細胞を1マイクロモルTSAと2ミリモルニコチンアミドで12時間処理します。これにより、脱アセチル化酵素を阻害することにより、タンパク質基質のアセチル化レベルが最大化されます。

トランスフェクションの48時間後、培地を取り出し、細胞をPBSで2回洗浄します。トリプシン処理によって細胞を収集し、続いて摂氏4度で1, 000gで10分間遠心分離します。細胞ペレットを溶解するには、プロテアーゼ阻害剤カクテル、1マイクロモルTSA、2ミリモルのニコチンアミドを含む500マイクロリットルの溶解バッファーAを皿ごとに追加し、摂氏4度で一定の回転下で30分間インキュベートします。

摂氏4度で15分間14, 000 gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。アガロースビーズに結合した抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行います(テキストプロトコールに記載)。溶出したサンプルを1ミリリットルあたり1マイクログラムに濃縮した後、精製したアセチル化タンパク質基質をマイナス80°Cに保ちます。

このプロトコールの重要なステップは、in vitro脱アセチル化反応の前に、タンパク質特異的抗体および抗アセチル化抗体を使用して、アセチル化タンパク質基質のタンパク質による精製を確認することです。in vitro脱アセチル化反応を開始する前に、脱アセチル化緩衝液Bを調製し、次に、この表に示すように、3つの異なるチューブでそれぞれ合計20マイクロリットルの3つの反応を調製します。3本のチューブすべてに精製アセチル化タンパク質基質と脱アセチル化バッファーBが含まれていますが、チューブ2には精製SIRT2も含まれており、チューブ3には精製SIRT2とNAD plusも含まれています。

SIRT2によるタンパク質-基質の脱アセチル化を確認するために、任意の第4の反応を含めることができ、これには、脱アセチル化酵素活性SIRT2の代わりにSIRT2の精製された脱アセチル化ヌル変異体が添加されます。反応を摂氏30度でインキュベートし、絶えず攪拌しながら3時間放置します。20マイクロリットルの2つのXサンプルバッファーを各チューブに加え、サンプルを摂氏95度で10分間沸騰させて反応を停止します。

続いて、反応混合物を4〜12%SDSページゲル上で分析し、アセチル化リジンに対する抗体を用いて、タンパク質基質のアセチル化状態をウェスタンブロッティングで検出します。このプロトコルを使用して、野生型SIRT2および脱アセチル化欠損変異体であるSIRT2 Hi87Yを、1マイクロリットルあたり1マイクログラムの最終濃度で精製しました。どちらのタンパク質もFLAGペプチドでタグ付けされているため、抗FLAG抗体を用いたイムノブロッティングにより精製を確認することができます。

タンパク質-基質およびアセチル化タンパク質-基質も精製した。抗アセチルリジン抗体を用いたイムノブロッティングにより、アセチルトランスフェラーゼを過剰発現する細胞における精製タンパク質のアセチル化レベルの上昇が確認されました。総タンパク質は、抗FLAG抗体を用いて検出しました。

in vitro脱アセチル化アッセイにおいて、精製されたアセチル化タンパク質基質を野生型SIRT2またはNAD plusの存在下で脱アセチル化欠損変異体とインキュベートすると、SIRT2の存在下で抗アセチルリジン抗体を用いたイムノブロッティングによりアセチル化レベルの低下が検出されましたが、変異体の存在下では検出されませんでした。NAD plusが反応混合物に含まれていない場合、脱アセチル化活性は観察されず、SIRT2がその酵素機能のためにNAD plusを必要とすることが確認されました。また、サーチュイン阻害剤であるNAMを反応混合物に添加すると、脱アセチル化が阻害され、これはタンパク質のアセチル化レベルの低下がSIRT2の脱アセチル化酵素活性によって媒介されることを示唆しています。

タンパク質を任意の酵素の脱アセチル化ターゲットと見なすためには、in vitroおよびin vivoの両方の脱アセチル化アッセイを実施して、脱アセチル化酵素と各基質との間の相互作用を確立する必要があります。特定の実験条件下での細胞におけるin vivo脱アセチル化アッセイは、生理学的および病態生理学的シナリオにおける脱アセチル化酵素と潜在的な基質との間の相互作用に関するさらなる洞察を提供し、生理学的状況における脱アセチル化イベントの機能的役割を確立することができます。多様な細胞プロセスの調節におけるサーチュインの役割に関する関心が高まっていることを考えると、記載されている脱アセチル化アッセイは、わずかな変更を加えて、細胞内局在に関係なく、サーチュインファミリーの他のメンバーの新しい基質を同定するために使用することができます。

特定の脱アセチル化酵素によって実施されるin vitroおよびin vivoの両方の脱アセチル化アッセイは、さらに小規模な質量分析と組み合わせて、基質上の標的リジンを明らかにし、機能的なアセチル化部位を非調節性のアセチル化リジンと区別することができます。