の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視 ex vivoでマウスの耳皮膚

この新しい実験プロトコルの全体的な目標は、完全に分化した機械感覚神経終末の機能を調査するために、マウスの耳の毛包のアクセシビリティを実証することです。この方法は、機械的感覚におけるシナプス様小胞の役割など、機械感覚神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の2つの主な利点は、迅速であること、および無数の生きた完全に分化した機械感覚神経終末への容易な光学的アクセスを提供することです。

一般に、この方法に不慣れな人は、毛包を損傷することなく皮膚を分離し、軟骨を適切に除去するのに苦労する可能性があります。ここでは、基本的なテクニックを示すだけでなく、神経末端機能の重要な部分のカルシウム依存性を調べる実験の例も示します。50ミリメートルのシリコンで裏打ちされた皿に、リリーの溶液またはその他の生理食塩水を入れます。

15分ごとに溶液を更新するか、一定の灌流を使用します。若い成体のマウスの首を切った後、はさみを使用して、密集したヘアラインのすぐ上にある基部近くの外耳を取り除き、皿の中の耳介を移します。次に、細い昆虫ピンを使用して、凹面を下にして、縁に沿って耳をピンで留めます。

次に、鈍い解剖を使用して、露出した後部の皮膚を慎重に剥がします。3番の鉗子を使用して中央の後皮をつかみ、別の鉗子で耳の付け根の皮膚と軟骨の間の隙間を突き刺します。隙間内で鉗子を左右に優しく動かし、前部と後部の皮膚層を徐々に分離します。

中央軟骨を横切って、軟骨のない細い縁まで体系的に移動します。これには練習が必要です。後部の皮膚を取り除いた後、真皮側を上にして、前面の皮膚の隣に固定します。

両方の皮膚製剤で軟骨が除去されたら、毛包の基部を覆っている泡状の線維弾性軟骨の層を取り除きます。このティッシュをそっと剥がし、摘み取り、こすり落とします。これもマスターするには練習が必要です。

除去量が少なすぎると、色素とその視覚化が妨げられ、除去しすぎると神経終末が損傷します。若いマウスを使用すると、前部と後部の皮膚層の間の接着と、下にある軟骨の除去が困難になります。これらは両方とも、染色が成功する可能性を高めます。

各皮膚製剤は、レプリカントの数を最大化し、使用する動物を最小限に抑えるために、頂点から基部まで半分にカットできます。このセクションでは、FM1-43で組織を染色する方法について説明しますが、このクラスの他のほとんどのスチリルピリジニウム染料では、濃度を適切に調整して機能するはずです。この手順は、最小限の周囲光レベルで実行します。

始める前に、適切なガスを注入した生理食塩水で、10マイクロモルのFM1-43を3ミリリットル分十分に新鮮にしてください。各製剤を、適切な生理食塩水2ミリリットルを入れた、シリコンで裏打ちされた別々の35ミリメートル皿に入れます。カルシウムとバリウムが色素の取り込みを維持する能力を比較するには、この時点から別々の皿でインキュベートします。

一部は通常のLiley's 2ミリモルカルシウムに入れ、その他はバリウムがカルシウムの代わりになるLiley'sに入れます。次に、オープンディッシュの準備を、摂氏30度の水浴のわずかに沈めたプラットフォームに置きます。水深は、皿にこぼれることなく組織を温めるのに十分である必要があります。

各皿に、シリコンベースに細いガスラインをピンで固定して、毎秒約10回の泡で製剤をガス化します。また、FM1-43溶液と100ミリリットルの無染料生理食塩水をしっかりと栓したボトルで温めます。すべてを摂氏30度まで平衡化させ、30分後、適切な温めた溶液を使用して、組織上の無染料生理食塩水を交換します。

さらに30分間インキュベートします。インキュベーション後、色素を含まない生理食塩水を注ぎ、調製物の周囲に残っている液体を迅速かつ慎重に拭き取ります。露出した真皮表面に触れないように注意してください。

調製物をウォーターバスに戻し、ガスラインを全体的に所定の位置に保持します。次に、カルシウムまたはバリウムを含む温かい染料溶液を2〜3ミリリットル加えます。40分後、残りの手順で組織を室温に戻して、内在化した色素の再放出を抑制します。.

次に、非内在化色素を3段階で除去します:まず、標識溶液を注ぎ、室温の生理食塩水で組織をすばやく3回すばやく連続してすすぎ、次に30分間インキュベートして、残りの色素の大部分を表面膜から分離します。最後に、必要に応じてカルシウムまたは生理食塩水で構成されたスルホン化b-シクロデキストリン誘導体で調製物をキレートすることにより、露出した膜の外部リーフレットに付着した残留性色素を取り除きます。したがって、残りのすべての染料は組織内にあります。

キレート後、調製物を適切な新鮮な無染料生理食塩水に戻し、皿の外側をティッシュペーパーで完全に乾かします。そして、できるだけ早くイメージ化してください。最小限の環境光の下で動作を続けます。

イメージングの前に、実体顕微鏡を使用して、自己蛍光を発して画像を汚染する表面の破片を取り除きます。次に、標準的なフルオレセインフィルターセットを備えた直立した落射蛍光顕微鏡の下にディッシュを配置します。次に、神経終末を快適に特定するのに十分なだけ調製物が照らされるまで、減光フィルターを使用して励起光強度を減衰させます。

完全な照明は、神経末端をかなり早く殺します。位置を特定したら、10倍乾式対物レンズまたは20倍水浸対物レンズを使用して、標識された披針形終末の画像を撮影します。1/2〜1秒のカメラ積分時間を使用して、光の強度と露光時間を最小限に抑えます。

各調製物について、耳介皮膚の基部の切断端から最も遠い縁から始めて、この縁に沿って作業し、各卵胞を順番にイメージングする約20の披針形の終末を画像化します。同じ卵胞を2回画像化したり、明らかに損傷した卵胞を画像化したりせずに、切断されたエッジに平行にわずかに重なり合うフィールドで作業します。マージナルストリップが完成したら、1フィールド幅を耳介の基部に向かって移動し、逆方向にプロセスを繰り返します。

解析はテキストプロトコルで記述されています。カルシウム含有生理食塩水で標識された卵胞を示す最初の皿をイメージングした後、バリウム含有生理食塩水で卵胞を画像化します。この方法で続行します。

標識後、色素はその後、構成的SLVリサイクルのエキソサイトーシスアームによって再び放出されるため、残りのコントロール組織と実験組織のイメージングが時間的に一致していることを確認します。典型的な耳介製剤では、毛包は蛍光を使わずに透過照明下で容易に観察でき、製剤のウェーハのような薄い性質と、これらの機械感覚端子へのアクセスが比較的容易であることを示しています。落射蛍光下では、各毛包を囲む標識された披針形末端がはっきりと見え、通常は強い自発的なFM1-43の取り込みを示しています。

点状パターンは、端子の長さに沿って、皮膚に直交する光学面で観察される端子を反映しています。この方法の多くの応用の1つは、エキソサイトーシス動態の研究です。予想通り、色素の取り込みが小胞のリサイクルによるものである場合、トップパネルでは、標識された末端が自然に脱染しているのが見られます。

エキソサイトーシスの強力な刺激剤であるα-ラトロトキシンを適用した後、下の2つのパネルに見られるように、自然な脱染プロセスが加速されます。ビデオで観察されているように、別のアプリケーションは、エンドサイトーシスのカルシウム依存性を調べることです。カルシウム含有生理食塩水とバリウム含有生理食塩水の両方で、披針形末端に明確な色素取り込みが見られました。

ビデオ中に標識された端子の蛍光強度を定量化したところ、色素の取り込みに有意差は見られませんでした。これは、エンドサイトーシスがバリウムとカルシウムによって等しくサポートされていることを示しています。他の耳の準備でこの手順をさらに繰り返すと、この結論がテストされます。

一度習得すれば、このプロトコルとイメージング全体を2時間半で完了させることができます。この手順を試みるときは、小さなマウスを使用すること、迅速に解剖すること、および必要な光強度を最小限に抑えるために最大限に暗順応することを覚えておくことが重要です。この方法のアイデアは、親しい同僚で現在は退職している教授のクラーク・スレーターと彼の修士課程の学生であるマイケル・ケインによって開発されたものから適応しました。

私たちは彼らに、筋紡錘の機械感覚におけるシナプス様小胞の役割の可能性について話しましたが、FM1-43よりも優れた視覚化方法が必要であることを話しました。この手順は、薬理学や電気生理学などの他の方法と組み合わせて使用することもできます。次に、シナプス様小胞のリサイクルがどのように制御されているか、そしてこれが機械感覚終末の応答性にどのように関連しているかを研究できます。