Name: の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録アフリカツメガエル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶアフリカツメガエルの嗅球における温度誘発カルシウム変化の記録法。電気穿孔とボーラスローディングを用いた神経活動可視化により、嗅覚処理における温度情報統合メカニズムを解明する手法を習得できます。

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>jove_content<このプロジェクトは、DFG Excellence Cluster 171、Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain、Bernstein Center for Computational Neuroscience、およびエラスムス・ムンドゥスの共同博士課程プログラムであるENC-Networkによって資金提供されました。著者らは、画像評価とデータ解析のための MATLAB コードとカスタム作成プログラムを提供してくださった Stephan Junek 氏、Mihai Alevra 氏、Guobin Bao 氏に感謝します。

<ol><li>Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+neurons+respond+to+cool+ambient+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures.</a> Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).</li>
<li>Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Grueneberg+ganglion+neurons+share+molecular+and+functional+features+with+C.+elegans+amphid+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons.</a> Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).</li>
<li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li>
<li>Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+correlation+imaging%3A+visualizing+function+and+structure+of+neuronal+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations.</a> Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis%22">Normal Table of Xenopus laevis</a>. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).</li>
<li>Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-controlled+device+for+the+application+of+odors+to+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrophysiol+Tec%22%5BJournal%5D)">A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals.</a> J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).</li>
<li>Bao, G., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Accurate+Fitting+and+Filtering+of+Noisy+Exponentials+in+Legendre+Space%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSONE%22%5BJournal%5D)">Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space.</a> PLoSONE. 9 (3), (2014).</li>
<li>Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+cytoskeletal+elements+in+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical Calcium Indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Salome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+using+acousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+imaging+for+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet imaging for systems neuroscience.</a> Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).</li>
<li>Hjorth, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+silent+cells%2C+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本明細書に提示される方法は、 アフリカツメガエルの嗅球に記録温度処理を目指すオタマジャクシをアフリカツメガエル 。第一プロトコル汚れや嗅球における二次ニューロンとは、嗅覚系は、主に無傷のままであるサンプル調製物を提供します。従って、温度感受性γ-糸球体の活性化をモニターし、その化学感受性隣接糸球体と比較することができます。この糸球体のユニークな二国間の神経支配は、スペクトルの異なる色素で細胞エレクトロポレーションにより可視化されます。また、ボーラスローディングは嗅球内の大ボリュームにまたがる僧帽細胞の染色を可能にします。神経回路網の処理温度によって誘起される信号は、反復刺激アプリケーションでカルシウム測定を行うと、その後の活性相関イメージングを使用してデータを分析することによって明らかにされます。 プロトコルは、2つの洗練された染色proceを強調します<html>満足と再現性のある結果を達成するために慎重な操作と実践を必要とどちらもデュレス、。エレクトロポレーションの間に、動物の任意の損傷は、鼻孔に電極を配置する場合は特に、避けなければなりません。最適には、嗅上皮との接触は発生しません。動物は依然としてエレクトロポレーション手順の後に住んでいると、その回復時間が考慮されなければならないことに注意してください。染色は、使用される染料の種類に応じて発生することができるエレクトロポレーションの一巡後弱すぎるままである場合、その強度は、鼻孔内の色素濃度を増加させることによって高めることができます。デキストラン結合分子は（1-2 MM / 10日目の速度で）遅い軸索輸送と受動拡散を含むいくつかのメカニズムを介して輸送されているので、別の代替は、動物を犠牲にする前に、エレクトロポレーション後48時間を待つことです。あるいは、エレクトロポレーションは、回復の1日後に繰り返してもよいです。 jove_content &quot;&gt;ボーラスローディング色素の量は、僧帽細胞に入るので、重要なステップは、制御が困難であり、ピペットチップのサイズとアプリケーションの位置など様々なパラメータに依存する。共焦点蛍光顕微鏡下で手順の監視をするために有用であることがわかります染料適用の持続時間を調整するので、製剤にわたって同様の染色結果を生成する。また、以前にエレクトロオタマジャクシは、（γ-糸球体を含む）小クラスターの位置を特定することにより、色素のアプリケーションに最適な位置を決定するために使用されるべきである。最も測定中の重要なステップは、サンプルのシフト及び退色の両方を回避することである。シフト注意深く顕微鏡下リンガーフローを配置することによって回避することができる。関心領域の漂白を制限するように、測定時間が重要に低減されるべきです。 カルシウム感受性色素を持つボーラスローディング染色は非常に提供します健康な細胞は一般的に低カルシウムレベルを有し、したがって、弱い基底蛍光を示すので、限られたコントラスト。活動の相関イメージングを適用すると、同様のカルシウムシグナルとの活動やハイライトの構造に基づいて、コントラストを生成することにより、この制限を回避します。このポスト取込み分析法は、3Dボリューム内で選択された関心領域（基準トレース）、各個々のピクセルのカルシウム信号との間の相関係数を算出します。したがって、強く得られた結果は、基準トレースとして選択された活動パターンに依存しています。主な焦点は、僧帽細胞の神経支配のパターンを可視化する場合、自発的神経活動に由来する基準信号が好ましく、最も活発な僧帽細胞を選択することが最良の結果を生成します。僧帽細胞の化学療法または感熱ネットワークを明らかにするために、唯一のヒスチジンまたは冷たいリンゲルのいずれかへの応答を含む参照トレースを選択する必要があります。全体糸球体oの選択rを関心領域として僧帽細胞体は、常に2つの異なる刺激に応答する構造が互いの上に横たわっている場合は特に、明確な基準トレースを提供することはできません。このような場合には、関心領域として糸球体または細胞体のより小さな領域を選択することがしばしば有用です。 過去数十年間では、エレクトロポレーションは、単一または複数のセル11,12を染色するための効率的な方法として記載されています。ここでは、特に嗅覚受容体ニューロンを標識するために使用されます。デキストランコンジュゲート分子は、最高の効率を与え、非カルシウム感受性色素のために、選択の範囲が広く、一般的に蛍光顕微鏡13で使用される完全なスペクトルをカバーしています。まだ市販されている場合は、成功した嗅覚受容ニューロンにエレクトロポレーションされているカルシウム感受性色素は、カルシウムグリーンデキストランに限定された瞬間にある、とのFluo-4デキストラン。また、録音は主にsuperficiaをターゲット唯一の嗅球の腹面にL層、高速測定技術の侵入深さが限られているからです。二光子イメージングは​​、部分的にこの制限を克服するが、多くの場合、速度を欠き、さらに選択可能なカルシウム感受性色素の量を制限することができます。 ここで嗅球における温度誘導活性を測定するためのプロトコルを記載しています。脳の神経網は、温度の嗅覚処理に関与する複雑な細胞ネットワークを可視化するために、3次元ボリュームとしてスキャンされます。嗅球で温度誘導活性を測定することは非常に最近5を報告し、異なる技術を組み合わせ、特にカスタマイズされた手順を必要とされています。上記の技術の主要な資産は、細胞の数百人が嗅覚系のほとんどが無傷のまま準備に3次元で画像化されていることです。これらの利点は、高い染色技術への要求だけでなく、脳pを置きます償いとイメージング。例えば、セルのエレクトロポレーションおよびボーラスロードは、嗅上皮および球で細胞を大量にヒットし、したがって完全な携帯電話ネットワークの可視化を可能にします。また、代わりに遺伝的にコード化された蛍光体のボーラスロードを介した化学指標の配信は、種の潜在的に大規模なセットでの測定を可能にします。 AM色素とバスのインキュベーションのような他の選択肢は、主に無傷組織のわずか数百マイクロメートルを残し、深刻な嗅球を損傷スライスで働いています。 γ-糸球体の二国間の神経支配は無傷のままと録音は、このように、まだ手術システムに取り込まれることを比較して、我々のプロトコルで使用されるホールマウントの準備は、例えば、保証されます。最後に、撮影自体は、3Dボリュームの取得を可能とするライン照明顕微鏡によって行われます。ライン照明顕微鏡は、可能な限り最高の取得率6を提供する共焦点技術の一つです&lt;/ SUP&gt;嗅球の大部分をカバーするために必要です。遅い取得システムが使用されるが、記録されたボリュームのサイズを小さくしなければならないという欠点を有していてもよいです。近年、高速な画像取得のための他の方法が開発されており、代替14,15として使用することができます。それにもかかわらず、ライン照明顕微鏡は、十分な速度と分解能の両方を獲得するための最も簡単な方法の一つです。ここでは、適切な画像のセットアップを選択するためのガイドラインとして、いくつかの情報を、次の。カルシウムイメージングが厚い脳の調製物からの内で行われているので、セットアップはまともな共焦点を提供すべきであると目的は、1.0以上の開口数を持つ必要があります。基準点のために、ライン照明顕微鏡で撮影した記録は0.5-1軽やかユニットのピンホールサイズの標準的なレーザ走査型顕微鏡で撮影した画像に相当します。高速取得速度が望ましいです。厚さ20μmの体積は、少なくとも5リットルで覆われてエアーズ、100ミクロン×100ミクロンの側方視野と0.5μm以下のピクセルサイズは、スタックあたり1ヘルツの最低速度でスキャンする必要があります。共焦点性を低減することが数えた光子の量を増加させ、必要に応じてこのように高速取得を可能にするが、より焦点外の光を記録するという欠点を有することができます。このようなアプローチは、光学切片の厚さを増加させるので、それは実際にACI 6の適用後に別のz平面を介して樹状突起の追跡を容易にすることができます。 広く嗅球ネットワークに温度処理を研究するために必要なツールは、本明細書で提示されています。温度誘発性の活性は、カルシウム感受性色素との信号到着およびγ-糸球体から逸脱することの両方を介して第1および第2次ニューロンに記録されています。さらに、個々の僧帽細胞は、化学的および温度情報の両方を評価することができるプロセスれる程度。準備LEAので、無傷の嗅球VES、嗅覚処理における二国間の神経支配の役割をさらに研究することができます。手順は、嗅覚ネットワーク5を重ねて符号化されているかどうか、およびどのように熱電とchemoinformation明らかにするのに便利です。最後に、上記の技術は、嗅球における温度応答の研究に限定されないが、大きな三次元ボリュームにおける嗅覚系、特に細胞処理ネットワークのより一般的な評価のために適用することができます。ボーラスロードと活動の相関イメージングは、異なる脳のネットワーク16にそれらを適用すること、ニューロンの数十の活動を観察し、比較するための強力なツールです。

ここ数年で、温度感受性はもはや単なる感覚感覚としてではなく、嗅覚系に関連する生理学的機能としても説明されるようになりました。げっ歯類では、主嗅球は、熱感受性ニューロンからなる鼻腔内の器官であるグルーネベルグ神経節(GG)から入力を受け取ります。GGニューロンは、低温1と化学刺激に応答し、その化学感受性は温度変動2によって調節されます。これらの観察結果は、嗅球が鼻で収集された化学的情報と温度情報を統合している可能性を示唆しています。この仮説を探るために、ここでは、Xenopus laevis幼虫をモデルとして、非トランスジェニック動物の嗅球の温度応答の検出を可能にする一連の実験を紹介します。これらの動物の嗅覚系の組織は、哺乳類のそれとよく似ています。変成前X.laevisの嗅覚受容体ニューロンは房状に終結し、僧帽細胞である二次ニューロンの樹状突起とシナプス接触を行います。シナプス前線維とシナプス後線維が混ざり合い、糸球体3と呼ばれるかせのような神経乳構造を形成します。糸球体層の豊富なシナプスは、嗅覚情報の最初の処理センターを表しています。僧帽細胞は、感覚入力をさらに統合し、それを高次嗅覚領域に伝えます。
私たちは、嗅覚受容体ニューロン(ORN)のエレクトロポレーションとカルシウム感受性および非感受性色素を組み合わせたプロトコルを開発しました。その後、糸球体と僧帽細胞のシナプス後ネットワークのボーラス負荷が続きます。鼻腔にロードされた2つのスペクトル的に異なる色素のエレクトロポレーションによる染色は、両方の嗅上皮からのORNによる両側神経支配を通じてγ糸球体3を選び出すのに役立ちます。したがって、γ糸球体の位置は、さらなる測定の前に特定されます。続いて、Fluo-8アセトキシメチル(Fluo-8 AM)を含むボーラスローディング4をγ-糸球体を含む容積中で行う。高速共焦点顕微鏡でカルシウムの変化をイメージングすることで、このシステム5で唯一の温度感受性糸球体であるγ糸球体を取り巻く3D神経粒子の温度応答を視覚化することができます。この特定の構造を神経支配する僧帽細胞は、誘導された温度低下に応答するCa2+シグナルによっても同定できます。次に、活性相関イメージング6は、これらの細胞の特異的なCa2+微量を用いて、熱感受性僧帽細胞の樹状突起形態を明らかにする。1回の測定で冷たいリンゲル溶液と化学臭気物質を交互に繰り返し適用することで、γ糸球体を取り巻く匂いと温度処理のための僧帽細胞ネットワークを視覚化し、潜在的な重複を特定できます。化学的刺激または温度刺激のいずれかに対する応答を明確に割り当てるために、嗅上皮の温度を常に監視します。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルクミリポア</td><td>1064040500</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルクミリポア</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>メルクミリポア</td><td>1023820250</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>メルクミリポア</td><td>1058330250</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>メルク ミリポア</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>メルク ミリポア</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>カルシウム グリーン 10 kDa デキストラン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン、アレクサ フルオア 647</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D-22914</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン、アレクサFluor 546</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>TEFlabs</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>MK571</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>340-021-M005</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>プルロン酸 F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>粉末</td></tr><tr><td>L-ヒスチジン一塩酸塩一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>メルク ミリポア</td><td>1029522500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>電動ピペット</td><td>BrandTech</td><td>HandyStep 電子繰り返しピペット</td><td></td></tr><tr><td>NiCr-Ni 熱電対</td><td>グライジンガー エレクトロニック</td><td>GTF 300</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>プーラー ナリシゲ</td><td>モデル PC-10</td><td>2段プーラー</td></tr><tr><td>ファンネルアプリケーター</td><td>(特注)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライン照明顕微鏡</td><td>(特注)</td><td></td><td>その他、市販のスピニングディスク顕微鏡</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>441470-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ W プランアポクロマート 40X/1.0 DIC</td><td>ツァイス</td><td>441452-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>R2010b 以降の</td> <td>MathWorks</td><td></td></tr></tbody></table>

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

化学分子の検出、統合、処理に特化した嗅覚系は、おそらく最も徹底的に研究された感覚系です。しかし、嗅覚は化学物質の感受性だけでなく、温度感受性も含むという証拠が山積しています。変成前のXenopus laevisは半透明の動物であり、鼻と嗅球を隔てる篩状プレートが奪われた突出した鼻腔があります。これらの特性により、嗅覚、特に熱感受性の研究に適しています。本稿では、X. laevis幼虫の嗅球の温度応答を測定するための完全な手順について説明します。まず、嗅覚受容体ニューロン(ORN)のエレクトロポレーションは、鼻腔にスペクトル的に異なる色素をロードして行い、眼球神経孔の軸索終末を染色します。左右の受容体ニューロン間の染色の違いは、γ糸球体が対側のシナプス前求心性神経によって神経支配される唯一の構造であることを特定するのに役立ちます。次に、エレクトロポレーションは、僧帽細胞とその樹状突起を染色するために、嗅球内の焦点ボーラスローディングと組み合わされます。次に、3D脳容積をライン照明顕微鏡でスキャンして、嗅上皮に小さな温度低下を誘発しながら、高速カルシウムイメージングデータを取得します。最後に、取得後の解析により、特定の温度誘起Ca2+トレースに基づいて、γ糸球体とその神経支配性僧帽細胞を含む感熱ネットワークの形態学的再構築が可能になります。温度の急上昇に加えて、化学臭物質を刺激として使用することで、嗅球の熱感受性ネットワークと化学感受性ネットワークの比較が可能になります。

嗅覚受容ニューロン（ORN類）のエレクトロポレーションは、アクティブな軸索輸送を介して、順行性標識のためのデキストランの分子と結合したアレクサフルオロ色素やカルシウム指標で達成されました。前者染料は電球の糸球体層で分岐感覚ニューロンおよびその軸索末端の明るい染色を提供するが、後者は、これらの細胞における神経活動の測定を可能にする（ 図1及び2）。まず、感熱γ-糸球体とその神経支配パターンの位置が左右の嗅覚上皮、（ 図1A）にアレクサフルオロ647デキストランおよびアレクサフルオロ546デキストランをエレクトロポレーションにより可視化しました。手続き後の二十四時間、鼻孔内のORN類は、2嗅神経と両半球における糸球体は、蛍光顕微鏡下で見ることができました。異なる糸球体クラスタはidentifiaましたそれぞれの立場によってBLE、γ-糸球体（ 図1B）を含む、特に小規模なクラスタ。反対側の嗅覚繊維の小さな数は前交連を渡り、同側γ-糸球体（ 図2A）に終了し、反対側の嗅球を駆け抜けました。 γ-糸球体のシナプス前繊維のカルシウム応答を記録するために、カルシウムグリーンデキストランは同じ手順に従って、ORN類に電気穿孔しました。負の温度ジャンプを氷冷リンゲル液の制御放出を介して鼻孔に誘導された（0-1°C）。 γ-糸球体を含む3Dボリュームは、高速のライン照明の共焦点顕微鏡で画像化しました。 -1°CΔTsがはΔF/ FのCa 2+トレースで可逆的なピークとして、γ-糸球体とその求心性神経で冷たい応答を誘発するのに十分に認識した（ 図2B &lt;/ strong&gt;の、C）。 さらに、実験の手順は、そのramifying樹状終末を経由してγ-糸球体に接続僧帽細胞に低温で誘導される活性を測定するために行きました。これらのシナプス後の繊維とその周辺の神経網を効果的に、カルシウム感受性色素のFluo-8 AMのボーラス負荷によって染色されたアレクサ647デキストランは、ORN類（ 図3A、B）にエレクトロポレーションされていた数日後に行われました。二回以下のパラダイムに従って僧帽細胞は、フルオ8 AMを充填した、と嗅上皮を刺激した：冷たいリンガー、ヒスチジン（10μM）と室温リンガーは、続いて適用されます。二つの基準トレースは、記録されたボリューム内の関心領域からの1つだけヒスチジン温度低下、他の1つに排他的に応答を採取しました。アクティビティ相関イメージング（ACI）6は、選択した基準に基づいて計算しました。高コントラストで温度やヒスチジン応答性のCa 2+シグナル（ 図3C、D）のいずれかに対応するシナプス後のネットワークの樹状形態を可視化するためのトレース。最後に、感熱性及び化学感受性マップを色分けし、温度および化学的情報は嗅覚二次ニューロン（ 図3E）に個々の糸球体から搬送される様子を示し、互いの上に重ね。共有嗅覚ネットワークの情報の両方のタイプの統合及び処理の説明については、Kludt ら5参照<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> 図1：ORNのエレクトロポレーションおよびボーラスロードの概要 （A）は、Xの両方の鼻腔内の嗅覚受容ニューロン。 ツメガエル幼生は、Alexa色素またはcalciuでエレクトロポレーションしましたデキストラン分子に結合されたメートル感受性色素。蛍光指示薬は、端末軸索樹枝状分岐まで順行性輸送されました。 24時間エレクトロポレーション後、両半球における糸球体層は、蛍光染色を示しました。 （B）1半球における嗅球の細胞組織の模式図。 、内側の小、中、横クラスター：糸球体層は、クラスタ内の電球にまたがります。嗅覚情報は、糸球体における興奮性シナプスを介して、僧帽細胞に受容ニューロンから転送されます。糸球体周辺細胞と顆粒細胞は、嗅覚処理と符号化を調節する抑制性ニューロンです。 γ-糸球体（シアン）を容易に同側（赤）と反対側（オレンジ）嗅覚繊維が合併小さな神経網として同定されました。 （C）ボーラスの負荷は、主に僧帽細胞とそのdendriからなるシナプス後神経網を染色するためにγ-糸球体付近で達成されました糸球体層にかなりの分岐チック木。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> 図2：ORN類のエレクトロポレーションは、構造的および機能的接続性を明らかにし 、同側（緑）によるγ-糸球体の（A）二国間の神経支配と反対側（赤）嗅覚受容ニューロン（ORN類）。 =50μmのスケールバー。 （B）カルシウム感受性色素カルシウムグリーンデキストランとのエレクトロポレーション後の嗅球。 intermedial（IMC）、内側（MC）と小さなクラスタ（SC）が表示されます。画像は、厚さ100μmの測定体積の最大投影です。 =50μmのスケールバー。 （C）小さなクラスタのクローズアップビュー。記録容量（12μm）があります最大投影で表現。画像は、オーバーレイとしてグレーと色分けされたΔF/ Fマップ内の基底蛍光レベルを示しています。冷リンゲル液での刺激に対する最大応答がプロットされています。隣接する二つの糸球体は黙秘しながら、γ-糸球体は強く反応しました。挿入図は、関心の示された領域に対応するγ-糸球体のためのΔF/ Fトレースを示しています。青いバーは、刺激のアプリケーションを表します。スケールバー=20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> 図3：小規模なクラスタで終端ORN類のボーラスロードとACIは、感熱および化学感受性のネットワークを解離 （A）軸索は、非カルチでエレクトロポレーションにより染色しましたええと感受性色素アレクサ647デキストラン。点線は、γ-糸球体の概要を説明します。カルシウム感受性色素のFluo-8 AMとボーラスロード後の第2の測定チャネルにおける（B）（A）と同じ領域の画像。一部の僧帽細胞の細胞体が見られたが、これに対しては限定的でした。矢印以下、2つの応答トレースが活性相関画像（ACI）のために使用された、プロットしました。ブルー、トレース以下の赤と黒のバーは、それぞれの冷リンガー、ヒスチジン（10μM）と室温リンガーなどのネガティブコントロールのアプリケーションの開始を示しています。 2のCa 2+トレースが測定した体積の関心の異なる領域から採取しました。 （C）（B）中の微量のACI結果冷たいリンガーに主に応答する領域を強調表示します。 （D）ヒスチジンに主に応答する（B）ハイライト領域における微量のACI結果。 2 ACIマップの（E）オーバーレイ。 hに応答する僧帽細胞istidineと神経支配糸球体（赤）は感熱僧帽細胞およびγ-糸球体（シアン）から容易に識別可能でした。この図のすべての画像は28ミクロン厚のボリュームの最大強度の投影です。スケールバー=20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、Xenopus laevisの嗅球の温度応答を測定し分析するためのプロトコルについて説明します。嗅覚受容体ニューロンと僧帽細胞を分次染色した後、カルシウムの変化が記録されますが、これは、鼻で誘発される温度低下に対する球根内の一部の神経ネットワークの感受性を反映しています。

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

本手順の全体的な目的は、鼻上皮で誘導された温度低下に応答して、嗅球ニューロンにおけるカルシウム変化を記録することです。この手法は、嗅球が鼻で取得した温度情報をどのように統合し処理するかといった、情動分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。嗅球の一次および二次ニューロンをそれぞれ異なる色で染色し、鼻上皮における温度変動の影響をカルシウムイメージングによって測定します。細胞のエレクトロポレーション、ボーラス負荷、および活性相関イメージングを視覚的に実演することで、嗅球以外の脳ネットワークにおけるこれらの手法の導入が促進されると考えられます。本手順を開始するために、オタマジャクシをゲルクッションの上に置きます。周囲に針を配置して固定しますが、その際、針が皮膚を突き刺さないように注意してください。次に、動物を実体顕微鏡下に置き、鼻孔に焦点を合わせます。その後、鼻腔の一方に染料結晶を配置し、完全に溶解するまで待ちます。これには通常1分未満かかります。結晶が小さい場合は、不透明で高濃度の溶液になるまで、各鼻腔に2～3個ずつ追加してください。その後、カソードをおたまじゃくしの皮膚に、アノードを片方の鼻孔に配置します。20 V、20 msのパルスを、刺激間隔を約0.5秒として6回印加します。極性の異なる染料を使用する場合、カソードを鼻孔に配置することで染色結果が改善されることがあります。染料の極性が不明な場合は、両方の電極を同時に鼻孔に挿入し、単一電圧パルスの間で極性を交互に切り替えることができます。動物を屠殺した後、メスを用いて、鼻腔、嗅神経、および嗅球を含む組織ブロックを切り出します。まず左鼻孔の近くで切開し、左嗅神経と嗅球に沿って終脳と間脳の境界まで刃を前方に進めて切断します。右側でも同様に繰り返します。次に、終脳の後方で最後に切断し、作製物を神経系の残りの部分から分離します。嗅神経の間に2本の針を刺し、組織ブロックを再度固定します。次に、組織の上にカエル用リンガー液を1滴滴下します。標本をリンガー液に浸すことで、解剖時に脳組織が崩壊するのを防ぐことができます。その後、3箇所の切開を行い、軸索ソート領域と嗅球を覆っている髄膜を除去します。組織ブロックの後端から開始し、左嗅球に沿って尾側から吻側へ、嗅神経が嗅球に進入する点まで密接に切断します。右半球についても同様の手順を繰り返します。その後、ピンセットで髄膜を持ち上げ、軸索選別帯（axon sorting zone）において、前の切断線に対して垂直に3回目の切断を行います。その後、さらなる処理およびイメージングを行うため、サンプルをFrog Ringerを満たした記録室に移します。腹側が上を向いていることを確認し、小さな白金フレームに張ったナイロン繊維のネットでサンプルを固定します。刺激をより容易に与えるため、鼻腔をナイロン繊維の一本の上に配置してください。この手順では、マイクロピペットに溶液を 10 µL 分注し、マイクロピペットを軽く叩いて気泡を取り除きます。次に、マイクロピペットをピペットホルダーに取り付けます。シリンジによる手動操作または空気圧式薬剤注入装置によって圧力を加えられる状態にし、ゲージで印加圧力を監視してください。次に、ピペットの先端を標本の吻側に向けるようにして、嗅球の表面まで下げます。ピペットの詰まりを防ぐため、マイクロピペットに小さく一定の正圧を加えます。マイクロピペットを組織内にゆっくりと挿入し、正圧を加えます。圧力をかけた際に、強光照明下で組織がわずかに動くのを確認し、ピペットからの流出を確認します。10分間の充填後、印加圧力をゼロにして染色の状態を確認します。染色領域の大きさは、注入した色素の量や噴出部位などのいくつかのパラメータによって大きく異なります。良好な染色は、約 100 micrometers × 100 micrometers の領域をカバーします。ボルス注入中の僧蓋細胞細胞体の段階的な染料取り込みを時間経過とともに観察してください。染色の強度や染色された僧蓋細胞の数が増加しない場合は、ピペットの詰まりを確認し、必要に応じて交換してください。このステップでは、清潔な温度計のプローブをチューブに挿入し、冷却したリンゲル液の温度をモニターします。実験を開始する前に、温度が1°C以下に下がるまで待ちます。次に、還流中のリンゲル液と同時に刺激を投与できるファンネルアプリケーターを使用し、刺激溶液の放出中もチャンバー内の水流が一定で途切れないようにします。次に、漏斗の遠位出口が嗅上皮から1 mm未満の距離になるように配置します。その後、デジタル温度計に接続したニクロム温度センサーを、上皮および漏斗アプリケーターの出口の近くに配置します。温度計の出力ポートをコンピュータに接続し、わずかな温度変動を反映する電圧変化を記録し、視覚的に表示させます。その後、画像取得を開始し、電子ピペットを用いて、刺激間隔を20～30秒として、冷却Ringer液、L-histidine、および室温Ringer液をそれぞれ200～400 µLずつ順次投与します。刺激投与をより正確に制御するため、可能であれば、選択したイメージングセットアップからピペットに送信されるトリガー信号で刺激を放出させてください。この手順では、取得した生データをx、y、z、t行列として整理し、MATLABユーザーワークスペースに変数として読み込みます。ここで、xおよびyは水平方向の寸法を、zは軸方向を、tは時間経過を表します。次に、MATLABコマンドラインからACIを呼び出します。UIで「Prepare Data」を選択し、データを含む変数と結果を保存するディレクトリを選択します。UIの対応するスライダーを動かして測定されたz層をスクロールし、表示される分散マップの概要を確認します。その後、UIにROIのサイズを入力します。僧帽細胞の細胞体の場合、ROIを水平方向に約10 µm、軸方向に約5 µmとなるよう調整してください。糸球体の場合、水平方向に20 µm、軸方向に10 µmという、わずかに大きな値が適切です。次に、マウスの中ボタンで細胞または糸球体の中央をクリックし、γ糸球体を含むROIと、周囲に見える僧帽細胞の各細胞体に対する追加領域を選択します。その後、メインUIを閉じると、すべてのリファレンス・トレースに対する相関マップの計算が開始されます。結果は自動的に保存され、表示されます。この画像は、小さなクラスターに終止するORNの軸索が、カルシウム非感受性染料であるAlexa 647 Dextranを用いたエレクトロポレーションによって染色されたことを示しています。点線はgamma糸球体を示しています。ここでは、カルシウム感受性色素であるFluo-8 AMをボルス投与した後の、第2測定チャネルにおける同一領域の画像を示しています。一部の僧帽細胞細胞体が見えましたが、コントラストは限定的でした。活動相関イメージングのために2つの応答波形をプロットしました。波形の下にある青、赤、黒のバーは、それぞれ冷Ringer液、10 µMのヒスチジン、および陰性対照としての室温Ringer液の投与開始点を示しています。ハイライトされた領域における、主にコールドリンゲル液に反応したトレースのACI結果をここに示します。そして、こちらはハイライトされた領域において主にヒスチジンに反応したトレースのACI結果です。この画像は、これら2つのACIマップをオーバーレイしたものです。ヒスチジンに反応する僧帽細胞および神経支配された糸球体は、ガンマ糸球体内の温度感受性僧帽細胞と容易に区別することができました。この手順を用いることで、嗅球における温度感受性と化学感受性が、潜在的かつ重複した神経ネットワークにあるかどうかを調査することが可能です。このビデオを視聴することで、生体動物への細胞エレクトロポレーション、ボーラスローディング、およびACI（Activity Correlation Imaging）とも呼ばれる活動相関イメージングを用いて、嗅球における温度処理をどのように記録するかについて十分な理解が得られるはずです。ボーラス負荷法とACIは、数十個のニューロンの活動とコネクティビティを3Dで観察・比較するための強力なツールであり、さまざまな脳領域やニューロンネットワークに容易に適用することが可能です。

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