の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録アフリカツメガエル

この手順の全体的な目標は、鼻上皮で誘発される温度低下に応答して嗅球ニューロンのカルシウム変化を記録することです。この方法は、嗅球が鼻で取得した温度情報をどのように統合および処理するかなど、愛情の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。嗅球の1次ニューロンと2次ニューロンは染色分別され、鼻上皮の温度変動の影響はカルシウムイメージングによって測定されます。

細胞エレクトロポレーション、ボーラスローディング、および活動相関イメージングの視覚的デモンストレーションは、嗅球以外の脳ネットワークにおけるこれらの技術の実装を容易にします。この手順を開始するには、オタマジャクシをゲルクッションの上に置きます。針を周りに置いて固定し、針が皮膚に突き刺さらないように注意してください。

次に、動物を実体顕微鏡の下に置き、鼻孔に焦点を合わせます。次に、鼻腔の1つに染料結晶を置き、完全に溶解するまで待ちます(1分もかかりません)。結晶が小さい場合は、各キャビティに2つまたは3つ追加して、非半透明の高濃度溶液を生成します。

その後、カソードをオタマジャクシの皮膚に置き、アノードを鼻孔の1つに置きます。20ボルトと20ミリ秒の6つのパルスを、約0.5秒の刺激間隔で印加します。極性が異なる色素の場合、カソードを鼻孔に配置することで染色結果が改善される場合があります。

染料の極性が不明な場合は、両方の電極を同時に鼻孔に配置し、単一電圧パルス間で極性を交互にすることができます。動物を犠牲にした後、メスを使用して、鼻腔、嗅神経、嗅球を含む組織のブロックを解剖します。最初の切開を左鼻孔の近くに行い、刃を前方に動かし、左嗅神経と球に沿って終脳-間脳境界まで切り込みます。

右側でも同様に繰り返します。次に、終脳の後方に最終的なカットを行うことにより、準備を他の神経系から分離します。嗅神経の間に2本の針を挿入して、ティッシュブロックを再度固定します。

次に、Frog Ringer溶液をティッシュに一滴垂らします。調製物をリンゲル溶液に浸すと、解剖時に脳組織が崩壊するのを防ぐことができます。その後、軸索選別ゾーンと嗅球を覆う髄膜を3回切開して取り除きます。

組織ブロックの後端から始めて、左の嗅球に沿って尾側を密接に切り込み、嗅神経の球根への入口点まで切ります。この手順を右半球に対して繰り返します。その後、鉗子で髄膜を持ち上げ、軸索選別ゾーンで3番目のカットを前のものに対して垂直にします。

その後、サンプルをFrog Ringerで満たされた記録チャンバーに移し、さらなる処理とイメージングを行います。腹側が上を向いていることを確認し、小さなプラチナフレームにナイロン繊維のネットを張ってサンプルを固定します。刺激を加えやすくするには、ナイロン繊維の1つの上に鼻腔を置きます。

この手順では、マイクロピペットに10マイクロリットルの溶液を満たし、マイクロピペットをフリックして気泡を取り除きます。次に、マイクロピペットをピペットホルダーに取り付けます。シリンジまたは空気圧薬物排出装置を使用して手動で圧力を加えることができることを確認し、ゲージで加えられた圧力を監視します。

次に、ピペットを嗅球の表面に下げ、先端を調製物の吻側方向に向けてください。マイクロピペットに小さく一定の正圧を加えて、ピペットの目詰まりを防ぎます。マイクロピペットを組織にそっと挿入し、陽圧を加えます。

圧力が加えられたときに明るい光の照明の下で見えるわずかな組織の動きを観察して、ピペットからの流出を確認します。10分間のローディング後、加えた圧力をゼロに下げ、汚れを確認します。染色領域のサイズは大きく異なり、注入される色素の量や排出部位の位置など、いくつかのパラメーターに依存します。

良好な染色は、約100マイクロメートル×100マイクロメートルの領域をカバーします。ボーラスローディング中の僧帽細胞体体の進行性色素ローディングを経時的にモニターします。染色強度や染色した僧帽細胞の数が増えない場合は、ピペットに目詰まりがないか確認し、必要に応じて交換してください。

このステップでは、清潔な温度計プローブをチューブに挿入して、冷却されたリンガーの温度を監視します。温度が摂氏1度を下回るまで待ってから実験を始めてください。次に、漏斗アプリケーターを使用して、灌流リンガーに同時に刺激を送達できるようにして、刺激溶液の放出中にチャンバー内の水の流れが一定で中断されないようにします。

次に、遠位出口が嗅上皮から1ミリメートル未満離れるように漏斗を配置します。その後、デジタル温度計に接続されたニクロム温度センサーを上皮と漏斗アプリケーターの出口の近くに配置します。温度計の出力ポートをコンピューターに配線して、volを記録し、視覚的に表示しますtage小さな温度変動を反映した変化。

その後、画像取得を開始し、200〜400マイクロリットルの冷リンゲル、L-ヒスチジン、および室温リンゲルを、20〜30秒のインタースティミュラス間隔で電動ピペットを介して順次適用します。刺激アプリケーションをより適切に制御するには、可能であれば、選択したイメージングセットアップからピペットに送信されるトリガー信号で刺激を解放します。この手順では、変数として取得した生データを MATLAB ユーザーのワークスペースに読み込み、x、y、z、t 行列として編成し、x と y は横方向の次元、z は軸方向、t は時間経過を参照します。

次に、MATLAB コマンド ラインから ACI を呼び出します。UI で [データの準備] を選択し、データを含む変数と結果を保存するディレクトリを選択します。UI の対応するスライダーを動かして、計測された Z レイヤーをスクロールし、表示されている分散マップの概要を確認します。

その後、ROIのサイズをUIに入力します。僧帽細胞体の場合、ROIを外側に約10マイクロメートル、軸方向に約5マイクロメートルに調整します。糸球体の場合、横方向に20マイクロメートル、軸方向に10マイクロメートルとわずかに高い値が適切です。次に、周囲の僧帽細胞の見える各体細胞のガンマ糸球体と追加の領域を含むROIを、マウスの中央ボタンで細胞または糸球体の中心をクリックして選択します。

その後、メイン UI を閉じると、すべての参照トレースの相関マップの計算がトリガーされます。結果は自動的に保存され、表示されます。この画像は、小さなクラスターで終末するORNの軸索を、カルシウム感受性のない色素であるAlexa 647 Dextranによるエレクトロポレーションによって染色したことを示しています。

点線はガンマ糸球体の輪郭を示しています。ここに示されているのは、カルシウム感受性色素Fluo-8 AMでボーラスをロードした後の2番目の測定チャネルの同じ領域の画像です。いくつかの僧帽細胞体腫が見えましたが、コントラストは限られていました。活動相関イメージング用に2つの応答トレースをプロットし、トレースの下の青、赤、黒のバーは、それぞれコールドリンガー、10マイクロモルのヒスチジン、および室温リンガーをネガティブコントロールとして適用した開始を示しています。

強調表示された領域のトレースのACI結果が、主にコールドリンガーに応答することを示しています。そして、これは、主にヒスチジンに反応する強調表示された領域のトレースのACI結果です。次の図は、2 つの ACI マップのオーバーレイを示しています。

ヒスチジンに応答する僧帽細胞と神経支配糸球体は、γ糸球体の熱感受性僧帽細胞と容易に区別できた。この手順は、熱感受性と化学感受性が嗅球の隠れた重なり合うニューロンネットワークにあるかどうかを調査するために実行できます。このビデオを見れば、生きた動物の細胞エレクトロポレーション、ボーラスローディング、活動相関イメージング(ACIとも呼ばれる)を使用して嗅球の温度処理を記録する方法について十分に理解できるはずです。

ボーラスローディングとACIは、数十のニューロンの活動と接続性を3Dで観察および比較するための強力なツールであり、さまざまな脳領域やニューロンネットワークに容易に適用できます。