Name: タンパク質のバイオコンジュゲートの合成経由でシステイン - マレイミドケミストリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶシステイン-マレイミドケミストリーを用いたタンパク質バイオコンジュゲートの合成法。サイト特異的な修飾により高収率で抗体薬物複合体などを作成でき、ナノ医療や蛍光顕微鏡研究に応用可能です。

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オーストラリア研究評議会（ARC)に対し、ARCフューチャーフェローシップ（FT120100101）およびARCセンターオブエクセレンス（CE140100036）)の助成金に対し、質量分析およびNMR施設へのアクセスについて、当事務所およびUNSWのマーク・ウェインライト分析センターに感謝します。

注： 図1に示すように、以下のプロトコルは、タンパク質-色素バイオコンジュゲートの合成のために設計されているノートが挿入されて膜タンパク質を支援するために、該当する場合それは、自由表面システイン含有タンパク質とのマレイミドの反応のための一般的なプロトコルです。バイオコンジュゲートは、タンパク質 - ポリマーバイオコンジュゲート、および合成タンパク質の二量体（タンパク質 - タンパク質）バイオコンジュゲート。この特定の場合において、タンパク質アイソ1シトクロムcは、高度に特異的な標識化が発生することを可能にする反応に利用できる一面のシステイン残基を有します。目的のタンパク質が複数のシステイン残基を有する場合は、同じプロトコルは、特異性と製品の均一性の損失にもかかわらず、適用されます。特異性は要求されない場合、表面リジン残基を標的とする化学的性質は、N -hydroxysuccinimidylエステルまたはイソチオシアネートを使用して、単純なアプローチであり得ます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt;図1. バイオコンジュゲーションの反応スキーム。例の場合、光収穫としては、ルテニウム系アンテナ分子は、（CYS102）ルテニウム系アンテナ分子上のペンダントマレイミドと露出したシステイン残基のマイケル付加を介してシトクロムcに添付されますタンパク質上。チトクロームcの表面の赤い部分は、ヘム基を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> シトクロムcの1精製注：このステップはすべてのタンパク質には適用されません。しかし、商業的供給業者から得られたタンパク質は、さらに精製13によって除去する必要があるかもしれない他の、望ましくないタンパク質アイソフォームを含むことができることを知っておくことが重要です。 <ol><li> PRに超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム（= 120 gでモル-1 W M）を2.4g溶解20mMのNaH 2 PO 4を含む緩衝液をepare。 pH7に1 M NaOHでpHを調整します。 注意：このプロトコルで使用されるリン酸緩衝液は、毎日新たに調製し、使用前に、0.2μmのセルロース膜フィルターを通して濾過されるべきです。 </li><li> 20 mMののNaH 2 PO 4および1 M NaCl緩衝液を作るために、塩化ナトリウムの29.22グラム（ ワット M = 58.44グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは）、ステップ1.6において精製のための溶出緩衝液です。 </li><li> pHが7〜20 mMリン酸緩衝液の6ミリリットルで凍結乾燥したシトクロムc（のcyt c）は 12.0ミリグラムを溶解させます。 </li><li>別々に1 Mのストック溶液を調製し、超純水を95.3μlのジチオスレイトール14.7ミリグラム（DTT、M W = 154.25グラム/モル）を溶解します。 注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようにDTTストック溶液を、新たに調製しなければなりません。 </li><li>ピップタンパク質溶液に1 M DTT溶液60μlのETTEは、チトクロームcを低減することができます。溶液の色は混合時に光赤に暗赤色に変わります。 </li><li>任意のクロマトグラフィー媒体に注入する前に、0.22μmの低タンパク質結合PVDFシリンジフィルターに通して減少したタンパク質溶液をフィルタリングします。 </li><li>注入ループと高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）装置の紫外可視検出器との間に3.3ミリリットルの強い陽イオン交換カラムを取り付けます。 </li><li> 1ml /分の流速を用いて、20mMのpH7のリン酸緩衝液の3カラム体積、続いて超純水の3カラム容量でカラムを平衡化。 </li><li>注入ループへの負荷減少粗チトクロームcの1ミリリットルを、そして328から勾配法開始- 5カラム容量を超える450のNaClを、。紫外可視検出器の280 nmおよび410 nmのチャネルを監視し、最大ピークを収集します。 </li><li> ISO-2チトクロムを溶出するために2カラム体積のために1 Mに塩濃度を増加させますE cおよびカラムをフラッシュした後、次の粗アリコートを注入する前に、リン酸緩衝液を20mMの2カラム容量でカラムを再平衡化。 </li><li>すべての粗タンパク質が精製されている繰り返して、1.9から1.10を繰り返します。 </li><li>プールイソ-1画分を含有し、それらは3.5 kDaの分子量カットオフ（MWCO）スピンフィルターを使用し、3000×gで遠心分離集中。 </li><li> 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮タンパク質をロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。 </li><li> 、10μLを取って超純水で100μlにそれを希釈し、吸光度スペクトルを取ることにより、純粋な濃縮タンパク質溶液の濃度を決定します。少量を使用し、100μlの石英キュベットは、タンパク質吸収スペクトルを得ました。 100μM - 一般的に、希釈していないタンパク質濃度は50程度です。 <ol><li> concentratioを定量化するためのcyt cの特性410 nmのピークを使用しますnは97.6センチメートル-1 mMの-1のモル吸光係数の値とランベルト・ベールの法則を使用して： A =ε×C×ι Aは吸光度であり、εはモル吸光係数は、cはミリモルでの濃度であり、ιは、CM 13におけるキュベットの経路長です。 </li></ol></li><li>この時点で、1mLのアリコートにタンパク質を分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 CYT cは凍結し、解凍した構造または機能を失うことなく、しかし、繰り返しサイクルは、タンパク質を変性し始めることができます。 注：タンパク質は、異なる程度に凍結耐えます。例えば、緑色蛍光タンパク質5,9の代わりに冷蔵庫に保存し、凍結されるべきではありません。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの2合成<ol><li>ルテニウムの0.9 mgのディゾルブ（II）bisterpyridine maleimIDEルテニウム（Ru（II）（TPY）2 -マレイミド、0.975マイクロモル、6当量）のアセトニトリル600μlのインチ 注：使用マレイミドは水溶性である場合、水の代わりに、アセトニトリル中のストック溶液を調製します。マレイミドは、反応緩衝液中で可溶性であることが重要です。ジメチルスルホキシド、N、N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリルは、低分子量12、多くの場合、疎水性のマレイミド反応物の溶解を助けるためにすべての一般的に使用されるアジュバントです。 </li><li> 20mMに希釈したときにEDTAが溶解するまで、典型的には（数グラムを固体水酸化ナトリウムを加えてpH 7で100 mMリン酸緩衝液および100mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、M W = 292.24グラム/モル）を含む緩衝液を調製）と、pHを7に調整します。 </li><li> 10mMのストック溶液を調製し、超純水1ml中のトリスの2.87 mgの（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP 15、M W = 286.65グラム/モル）を溶解させます。このステップは、インポートされアリは、タンパク質上のシステインが完全に15を連結するマレイミドの前に低減されることを保証します。 注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようTCEP原液は、それぞれの反応のために新たに調製しなければなりません。 </li><li> 50ミリリットルプラスチックチューブで100 mMリン酸/ EDTAストック溶液3mlで超純水11.4ミリリットルを兼ね備えています。タンパク質およびマレイミド原液でさらに希釈すると緩衝液濃度を20mMになります。 注：標識されたタンパク質は膜貫通タンパク質である場合、適切な界面活性剤は、タンパク質を可溶化するために緩衝液に添加されていることを確認します。洗剤を使用しない場合は、膜タンパク質が徐々にマイナスの反応収率に影響を与えるであろう、沈殿ができます。すべての後続の精製工程で洗剤を使用してください。 </li><li>リン酸EDTA緩衝液に精製されたチトクロームcの0.15マイクロモル（50μM溶液3ml、1当量）を追加します。 </li><li> TCEPストックsolutの7.5μLを追加タンパク質溶液にイオン（0.075マイクロモル、0.5当量）とは、システイン酸化による二量化している可能性のあるタンパク質を減らすために5分間攪拌したままにしておきます。 注意：目的のタンパク質が容易に二量体化していない場合TCEPを追加しないでください。非還元条件下でタンパク質ゲルを実行することによってこれを確認してください。 </li><li> 24時間、室温で、暗所でのRu（II）（TPY）のcyt cの減少、緩衝溶液に2 -マレイミドのアセトニトリル溶液600μlを添加し、反応混合物の攪拌を残します。 </li><li>ろ液が透明に実行されるまで、新鮮な20mMのリン酸緩衝液で2〜​​3回繰り返し、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを用いて反応混合物を濃縮します。精製の次の段階の前に、可能な限り、反応混合物からできるだけ多くの未反応のマレイミドを削除します。 注：この時点で、粗製のバイオコンジュゲーション混合物を、暗所で、冷蔵庫で保存することができます。 CENTRにより未反応のマレイミド色素を除去することが重要です保存前の透析ifugeマレイミドのようにゆっくりと非特異的にタンパク質の表面上のリジン残基と反応することができます。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの3精製<ol><li> 20mMのNaH 2 PO 4、0.5 M NaClを含む緩衝液を調製し、超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム2.4gの塩化ナトリウムの29.22グラム溶解します。これは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）精製のためのランニングバッファーです。 </li><li>イミダゾールの17グラム（ ワット M = 68.077グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4および0.5MのNaCl緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは、IMAC精製の溶出緩衝液です。 </li><li> 1 M NaOHまたはHClを用いてpH7に両方のバッファのpHを調整し、FPLCで使用する前に0.22μmの再生セルロース膜を介してそれらをフィルタリングします。 </li><li>購入したIMACカラムは、COL上にロードされた任意の金属イオンなしで出荷されているようにUMN、Niのためにカラムを準備2+ベースの超純水を3ml、100mMの酢酸ニッケル溶液3mlでカラムを洗浄することによって精製し、超純水6mLを。カラムをすぐに使用しない場合の20％エタノール3mlのを通して洗浄し、細菌の増殖を防ぐために冷蔵庫に列を格納します。 </li><li> Ni 2+を取り付け注入ループとUV-Visの検出器との間FPLCに1ミリリットルIMACカラムを-loaded。 </li><li> 20mMのリン酸の3カラム体積、0.5ml /分の流速を用いて0.5 M NaCl緩衝液でカラムを平衡化します。 </li><li>負荷のNi 2+ IMACカラム（0.22μmのシリンジフィルターで濾過）粗反応混合物100μlの。 （C -cytのRu（II））ルテニウムbisterpyridineシトクロムCのバイオコンジュゲートを溶出するために、3カラム容量にわたって0からmMの125にイミダゾール勾配が続く未反応のチトクロームcを溶出するためにランニングバッファーの3カラム容量でカラムを洗浄。 </li><li> Cを洗いますすべての粗バイオコンジュゲートを精製されるまでolumn 5カラム容量のための250 mMのイミダゾール緩衝液で、その後、20 mMのリン酸、0.5 M NaClおよび繰り返しステップ3.7でカラムを再平衡化。 </li><li>バイオコンジュゲートの画分をプールし、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを使用してそれらを集中。 </li><li> 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮されたバイオコンジュゲートをロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。 </li><li>純粋の濃度を決定し、410 nmでISO-1シトクロムc（97.6 mMの-1 cm -1 で ）同じモル吸光値を使用して、UV-Visのことでバイオコンジュゲート液を濃縮しました。 100μM - 一般的に、バイオコンジュゲートの濃度が50程度です。 </li><li> 25μlのアリコートにバイオコンジュゲートを分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの4キャラクタリゼーション<ol><li> 抑止しますMALDI-TOF MSによるバイオコンジュゲートの質量のmination <ol><li>アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸溶液1mlにカフェー酸10mgを溶解し（80：20：0.1、v / v / v）です。 </li><li>コー​​ヒー酸溶液5μlの濃縮タンパク質溶液5μlを希釈します。 </li><li> MALDIターゲットプレート上のコーヒー酸溶液0.5μLを発見し、解決策を乾燥させます。 </li><li>スポット0.5は、このカフェー酸スポットの上にサンプル/マトリックス溶液μL、スポットが乾燥することができます。マトリックスの層の間のサンプル「サンドイッチ」にこの上にサンプルマトリックスの別の0.5μLをスポットし、乾燥させます。 </li><li>タンパク質16に適した機器の設定を使用してリニアモードで質量スペクトルを取得します。 </li></ol></li><li> ゲル電気泳動によるバイオコンジュゲートの調査 <ol><li>予混合ドデシル硫酸リチウム（LDS、pHは8.4）緩衝液（4×）トンでタンパク質試料を希釈することによって実行されるように、各タンパク質試料を10μlの準備OAウェルあたり約20μgのの最終濃度。条件を減らす必要が井戸の場合、エージェント（10倍）を低減500mMのジチオスレイトール（DTT）の1μlを添加します。 </li><li> 10分間70℃で熱サンプル。 </li><li>ゲルランニングバッファーを準備するために予混合の50mlの1M MES、1Mトリス塩基、2％SDS、20mMのEDTA（pHは7.7）の超純水950ミリリットルに商業的供給源から緩衝液混合物（20倍）を実行を追加します。 </li><li>ゲルからプラスチック製の櫛を削除し、ゲルランニングタンク内のゲルを置きます。ウェルを緩衝液で覆われているように、ゲルランニング緩衝液でタンクを埋めます。 </li><li>慎重にプレキャスト12％ビス - トリス、1ミリメートル、ロードを支援するために、長いピペットチップを用いて10ウェルのゲル上にロードしたサンプル。分析を助けるために、ゲルの中央のウェルに予備染色10タンパク質分子量マーカー（3から188キロダルトン）をロードします。 </li><li> 35分間200 Vの定電圧でゲルを実行します。 </li><li> 2時間商用クマシーブルー溶液でゲルを染色し、ultrapで洗浄48時間URE水。 </li></ol></li><li> 紫外可視分光法によるバイオコンジュゲートの純度の決意 <ol><li> Ruを5μMソリューション（II）（TPY）2 -マレイミド、イソ-1のcyt c、およびルテニウム（II）-cyt C120μlのを準備します。 </li><li> 250 nmのから650 nmまで、唯一の超純水を含む石英キュベットのベースラインスペクトルを測定します。 </li><li>キュベットは、各測定間ですすぎ、乾燥されることを保証、各成分のスペクトルを測定します。 </li><li>波長の関数としての各成分の吸光度をプロットし、そして1かどうかを決定するために、最終製品に、出発物質の線形和を比較：ルテニウム（II）（TPY）CYTのC 2 -マレイミドの1比率が反応しました。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

バイオコンジュゲーションの前に出発物質の精製は、最も重要です。商業的な組換え供給源から得られたタンパク質は、しばしば、異なる表面化学と反応性を有することができ、目的のタンパク質の他のアイソフォームを含みます。例えば、記載生体結合に、市販のcyt cが両方イソ-1およびイソ-2のcyt Cの 12,14,17の混合物が含まれています。シトクロムcのISO-2およびISO-1形態は、主な違いは、ISO-1シトクロムcのC末端の近くに遊離システイン残基の存在であると、大部分が相同である。この例では、精製は、水性強力で達成されます陽イオン交換FPLCは、しかし、そのような陰イオン交換、アフィニティー、疎水性、またはサイズ排除クロマトグラフィー、FPLCの他の形態は、より適用可能です。タンパク質はまた、目的のタンパク質（ここではシトクロムc）上のシステイン残基はFUであることを確認するために、このステップで減少されますLLYマレイミド連結された標的とバイオコンジュゲーションの前に減少しました。また、タンパク質を含有する...

バイオコンジュゲーションは、共有結合相互に、またはそのような染料、薬物またはポリマーなどの合成分子と1の生体分子を結合することを含みます。タンパク質バイオコンジュゲーション法の広範囲な蛍光色素標識1,2に至るまでのアプリケーションで多くの化学、生物学、ナノテクノロジーの研究グループで使用されている、タンパク質の作成 ​​（抗体）3（抗体薬物複合体- ADCを）-prodrugsタンパク質二量体4,5の合成、ナノメディシン8およびシステム化学9で使用される自己集合タンパク質-ポリマーハイブリッド6,7に至ります。 標的タンパク質の活性部位を妨害しないように、バイオコンジュゲーションのために使用される化学反応の特異性は、必ずしも重要ではないが、ほとんどの機能性タンパク質のバイオコンジュゲートのために最も重要です。 、目的のタンパク質上のI）を標的と希少または固有のサイト：理想的な生物結合反応は、以下を含む、いくつかの基準を満たす必要がありますⅱ）ⅲ）タンパク質のアンフォールディングを回避するために、非変性条件下で進行、この目標に向かって選択的かつ標的タンパク質は通常、サブミリモル濃度でのみ使用できますようⅳ）高収量になります。マレイミド-システインマイケル付加は、これらすべての基準を満たすに近づくと、その理由のために長いバイオコンジュゲート化学10の分野で特別な地位を主張しています。私は、その表面上に一つのシステイン残基は、遺伝子が操作することができる含む）多くのタンパク質は、ii）の反応は、システインに向かって高度に選択的であり、正確なpHで、III）は、水性緩衝液中で円滑に進行し、iv）は、それが非常に高速であるためであります5,000 M -1秒を超える-1 11いくつかのケースで報告されたシステイン含有タンパク質に対するマレイミドの二次速度定数を有します。提供目的のタンパク質は、有機共溶媒12の小（≈五から十パーセント）の量、ほぼすべてのマレイミド官能染料、経口に耐えることができますlymerは、表面又は別のタンパク質は、タンパク質に結合させることができます。また、マレイミドは、上昇したpHで他の求核試薬と反応させることになりやすいですヨードアセトアミド、よりタンパク質上のシステインのために、より特異的です。およびジスルフィド交換13を防止するために、酸性pHで維持する必要がジスルフィドベースの活用よりも安定。 ここでは、（II）、Ruの間の反応を使用して、単一のシステイン残基を含有するタンパク質とマレイミド官能化分子の結合のための一般的なプロトコルを報告例として、発色団と酸化還元タンパク質シトクロムcをベース。このプロトコルは、アクセス可能な表面のシステイン残基と対応するマレイミド官能化標的を含むほとんどの他のタンパク質にも同様に適用可能であり、それは別のタンパク質、蛍光色素、発色団または合成ポリマーです。

<table><tbody><tr><td>リン酸二水素ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71691</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>シトクロム c、出芽サッカロマイセス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2436</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>東ソー SP-5PW, 07161</td><td>3.3 ml 強陽イオン交換カラム</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC900308</td><td>3.5 kDa スピンフィルター</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer ミニ透析ユニット</td><td>Thermo Scientific</td><td>66333</td><td>3.5 kDa 透析カセット</td></tr><tr><td>Ru(II) ビスターピリジン マレイミド</td><td>ラボ製</td><td></td><td>参照 (14)</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3396</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93284</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルアセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244066</td><td></td></tr><tr><td>AcroSep IMAC Hypercell カラム</td><td>Pall</td><td>via VWR: 569-1008</td><td>1 ml IMAC カラム</td></tr><tr><td>0.2 ミクロン セルロース メンブレン フィルター</td><td>Whatman</td><td>Z697958</td><td>47 mm バッファー用</td></tr><tr><td>0.2 ミクロン PVDF メンブレン フィルター</td><td>メルク・ミリポア</td><td>SLGV013SL</td><td>タンパク質用シリンジフィルター</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>84426</td><td>非常に腐食性が高い!注意してください。</td></tr><tr><td>カフェイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60018</td><td>MALDIマトリックス</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td>非常に腐食性が高い!</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC6060</td><td>Coomassie blue solution</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0342BOX</td><td>precast protein gels</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td>premade protein ladder</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td>既製ゲルサンプルバッファー</td></tr><tr><td>NuPAGE サンプル還元剤 (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0004</td><td>既製ゲル還元剤</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS ランニングバッファー (20x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0002</td><td>既製ゲルランニングバッファー</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acta FPLC</td><td>GE</td><td></td><td>Fast Protein Liquid Chromatography</td></tr><tr><td>Cary 50 Bio Spectrophotometer</td><td>Varian-Agilent</td><td></td><td>UV-Vis</td></tr><tr><td>Milli-Q 超純水ディスペンサー</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>超純水</td></tr><tr><td>少量 UV-Vis キュベット</td><td>Hellma</td><td>105-201-15-40</td><td>100 マイクロリットル キュベット</td></tr></tbody></table>

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

タンパク質の蛍光色素、薬物、ポリマー、その他のタンパク質への化学的結合または生体結合は、抗体薬物複合体(ADC)の開発、ナノメディシン、蛍光顕微鏡、システム化学など、幅広い用途があります。これらのアプリケーションの多くでは、使用されるバイオコンジュゲーション法の特異性が最大の関心事です。標的タンパク質にシステインを添加したマレイミドのマイケル付加は、選択性が高く、温和な条件下で急速に進行するため、タンパク質バイオコンジュゲーションの最も一般的な方法の1つとなっています。
ここでは、酵母シトクロムc上の唯一の表面アクセス可能なシステイン残基をルテニウム(II)ビステルピリジンマレイミドで修飾する方法を示します。タンパク質バイオコンジュゲーションは、ゲル電気泳動によって検証され、水系高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって精製され、単離されたタンパク質材料の収率が27%になります。次に、MALDI-TOF MSおよびUV-Visによる構造特性評価を使用して、バイオコンジュゲーションが成功したことを確認します。ここに示すプロトコルは、他のシステイン-タンパク質と他のタンパク質、染料、薬物、またはポリマーへのマレイミドカップリングに容易に適用できます。

図2に示すように 、飛行質量分析（MALDI-TOF MS）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および紫外-可視（UV-Vis）で分光法のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間：バイオコンジュゲートの合成は、3つの主要な方法によって確認されます3,4。添付の小分子の質量に対応する質量の増加、および未反応のタンパク質の欠如は、Ru（II）の成功した共有結合（TPY）のcyt cおよびバイオコンジュゲートのその後の精製に2 -マレイミドを示しています。バイオコンジュゲートの組成を推測することができる出発物質の1加算スペクトル：バイオコンジュゲートのUV可視スペクトルは、収率は410 nmであり、予測された1のスペクトルを比較して吸光度を用いて計算されることを可能にします。上記の例では、収率がFPLCのpurifica後に15から27パーセントの間で一般的にそれをバッチ間から多少変化するが、る<su...

このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

システイン-マレイミド化学を用いてタンパク質バイオ共役物を合成する全般的な目的は、タンパク質上の修飾部位に特異性を持たせることです。これは結果として、抗体薬物共役体などの得られたバイオ共役物の活性に影響を与えます。タンパク質の構造や機能に関心があり、ナノ医学、蛍光顕微鏡法、またはシステム化学の研究を行っている場合、この手法は疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、より多くの条件下で高い特異性と高収率が得られることです。この手順を開始するには、12 milligrams の凍結乾燥した cytochrome C を 6 milliliters の 20 milimolar リン酸緩衝液に溶解します。cytochrome C を還元させるため、調製したばかりの 1 molar DTT 溶液 16 microliters をタンパク質溶液にピペットで加えます。溶液を混合した後、クロマトグラフィー担体に注入する前に、0.22 micron の低タンパク吸着 PBDF シリンジフィルターでろ過します。次に、還元された粗シトクロムC溶液を、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）を用いて精製します。強陽イオン交換カラムを平衡化した後、溶液1 mLを装置の注入ループにロードします。次に、5カラム分量かけて、328 mMから450 mMの塩化ナトリウムへのグラジエント法を開始します。UV可視検出器の280および410ナノメーターチャンネルをモニタリングし、最大のピークを回収します。次に、塩濃度を1 Mに上げ、2カラム分流してISO2 cytochrome Cを溶出させます。カラムを洗浄した後、次の粗抽出液分画を注入する前に、20 mMリン酸緩衝液を用いて2カラム分再平衡化します。この時点で、適切なルテニウムマレイミド複合体0.9 mgを600 µLのアセトニトリルに溶解します。2.87 mgのTCEPを1 mLの超純水に溶解し、10 mM TCEP溶液を調製します。50 mLプラスチックチューブに、超純水11.4 mLと100 mMリン酸-EDTAストック溶液3 mLを混ぜ合わせます。次に、リン酸-EDTA溶液に精製したシトクロムCを0.15 µmol加えます。7.5 µLのTCEPストック溶液をタンパク質溶液に加えます。システインの酸化によって二量体化した可能性のあるタンパク質を還元するため、5分間攪拌し続けます。次に、還元後の緩衝液中シトクロムC溶液に600 µLのルテニウムマレイミド錯体溶液を加え、反応混合物を室温の暗所で24時間攪拌します。添加順序は極めて重要です。まずタンパク質を加え、次に還元剤を加え、最後にマレイミドを加えることが不可欠です。翌日、3.5 kilodaltonの分子量カットオフ（MWCO）のスピンフィルターを用いて、遠心分離により反応混合物を濃縮します。ろ液が透明になるまで、新鮮な 20 millimolar リン酸緩衝液を用いて遠心分離を2〜3回繰り返します。ニッケルベースの精製では、1 milliliter の金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを、3 milliliters の超純水、3 milliliters の 100 millimolar 酢酸ニッケル溶液、および 6 milliliters の超純水で洗浄します。その後、ニッケルを充填したカラムを、注入ループとUV検出器の間に FPLC で接続します。次に、20 millimolar リン酸、0.5 molar 塩化ナトリウムバッファーを3カラム分流し、流速 0.5 milliliters per minute でカラムを平衡化します。0.22 micron シリンジフィルターでろ過した後、粗反応混合液 100 microliters を装置の注入ループにロードします。バッファーを3カラム分流してカラムを洗浄し、未反応の cytochrome C を溶出させます。その後、0から125 millimolar までの Imidazole グラジエントを用いて、3カラム分かけて cytochrome C バイオ接合体を溶出させます。シトクロムCバイオ共役物がカラムから溶出した後、250 millimolar Imidazoleバッファーでカラム5回分（5 column volumes）の洗浄を行います。次に、20 millimolar リン酸 0.5 molar 塩化ナトリウムバッファーでカラムを再平衡化させます。その後、バイオ共役物の画分を回収します。そして、3.5 kilodalton 分子量カットオフのスピンフィルターを用いて遠心濃縮します。遠心後、濃縮したバイオコンジュゲートを 3.5 kilodalton 分子量カットオフの透析カセットに充填し、超純水に対して一晩透析します。翌日、UV-Vis 分光法により、精製濃縮されたバイオコンジュゲート溶液の濃度を測定します。410 nmにおけるISO1シトクロムCと同じモル吸光係数を使用します。残りのバイオコンジュゲートは、25 µLずつ分注し、-20 °Cで保存してください。ゲル電気泳動では、バイオコンジュゲートを調製済みのリチウムドデシル硫酸緩衝液で希釈し、1ウェルあたり最終濃度が約20 µgとなるように各タンパク質サンプルを10 µL準備します。次に、サンプルを70 °Cで10分間加熱します。サンプルを室温まで冷却した後、ロングピペットチップを使用して、 carefullyにプリキャスト12% bis-tris、1 mm 10ウェルゲルにロードします。解析を容易にするため、ゲルの中央のウェルにプリステイン10タンパク質分子量マーカーをロードします。次に、200 Vで35分間ゲル電気泳動を行います。泳動終了後、市販のクマシーブルー溶液を用いてゲルを2時間染色します。クマシーブルー溶液を除去した後、超純水でゲルを48時間洗浄します。シトクロムCバイオコンジュゲートのマルチTOF質量分析スペクトルにおいて、未反応のタンパク質が存在せず質量が増加していることから、ルテニウムマレイミド錯体がシトクロムCに等量結合し、その後のバイオコンジュゲートの精製が成功したことが示されました。シトクロムCバイオコンジュゲートの収率は一般に15%から27%の間であり、UV-Visスペクトルから算出できます。このバイオコンジュゲートは、マレイミドがタンパク質に1対1で結合した状態で構成されています。これは、バイオコンジュゲートのスペクトルを、出発物質の1対1付加として予測されるスペクトルと比較することで推論されます。さらに、精製中のクロマトグラムに新しいピークが出現することで、新種の合成が確認されます。この手順を習得し適切に実施すれば、3日間で完了させることができます。この手順を行う際は、サンプルへのタンパク質の混入を防ぐため、手袋を着用し、タンパク質溶液を慎重に扱うことが重要です。この手順は、システイン含有タンパク質への他のマレイミドの接合にも利用可能です。また、膜タンパク質が生存している原生動物の膜内に存在するかどうかなど、追加の疑問を解消するためにも活用できます。この手法の開発により、生体分子分野の研究者が、粘性などの制約下におけるタンパク質の機能と局在についてより深く理解することが可能になりました。このビデオを視聴することで、高い収率で生体高分子を標識するために、システイン・マレイミド化学をどのように活用すべきかを十分に理解できるはずです。特性が未知の研究用化学物質を取り扱う際は、極めて危険である可能性があることに留意してください。また、本手順の実施にあたっては、PPE（個人用保護具）などの適切な予防措置を講じる必要があります。

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学ぶシステイン-マレイミドケミストリーを用いたタンパク質バイオコンジュゲートの合成法。サイト特異的な修飾により高収率で抗体薬物複合体などを作成でき、ナノ医療や蛍光顕微鏡研究に応用可能です。

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成

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