成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

この実験の全体的な目標は、無傷の後根神経節を調製する方法を導入し、この調製物を使用してパッチクランプ記録を行うことです。この方法では、無傷の背根神経節からの単一細胞記録が可能になり、入射する脊髄神経または出る背根を刺激します。このアプローチは、一次感覚ニューロンの痛みへの寄与を研究する場合に特に役立ちます。

この技術の主な利点は、ニューロンと隣接する衛星グリア細胞の両方を維持することです。したがって、この調製物はin vivoの状況により近い。この手順では、ラットに麻酔をかけた後、腰部を剃ります。

次に、正中線に沿って皮膚と皮下組織を切開します。その後、細かい骨膜エレベーターを使用して、L1からS2レベルの棘突起から脊髄周囲筋を切り離します。次に、L1からS2への棘突起を切断します。次に、露出した脊柱の約L1とS1に2つの横方向の切り込みを入れ、脊柱のこのセグメントを一括して除去します。

その後、すぐに冷たいaCSFに2〜3分間浸します。その後、切除した脊柱から血液を洗い流し、冷たいaCSFを入れたシャーレに椎骨柱を移し、細いロンジュールを使用して椎弓状を取り除きます。硬膜を正中線に沿ってマイクロハサミで切り込み、脊髄を露出させます。

次に、DRGで残りの椎骨を冷たいaCSFで満たされた2番目のシャーレに移します。L4およびL5 DRGは、横突起および坐骨神経に対する相対的な位置に基づいて特定します。次に、DRGを周囲の結合組織から解放し、神経根と脊髄神経をDRGに付着させたままにします。

その後、DRGを3番目のシャーレに移してさらに解剖します。背根と腹根がDRGに結合する開口部を切り取り、腹根をDRGから分離します。次に、先端が鈍い鉗子を使用して神経上膜を保持し、別の細い鉗子を使用して神経上神経からDRGを転がします。

DRGに付着している神経上膜をできるだけ多く除去し続けます。次に、DRGを録音チャンバーに移します。神経根が起点となるDRGの側が下を向いていることを確認してください。

次に、アンカーでDRGを安定させます。次に、蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを介してDRGに酸素化aCSFを灌流し、細胞を30分間回復させます。30分後、CCDカメラを使用して、IR-DIC光学系で40倍の倍率でDRG品質を評価します。

2本の1ミリリットルシリンジを小径のゴムチューブ2本でピペットホルダーに個別に接続。次に、コラゲナーゼを充填したガラスピペットをピペットホルダーの1つに、空のガラスピペットをもう1つのピペットホルダーに入れます。その後、マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットをDRGのすぐ上に配置します。

2つのピペットの先端を互いに優しく衝突させて、ピペットの先端の開口部を拡大します。その後、コラゲナーゼを充填したピペットをDRG表面に近づけます。プランジャーを約0.5ミリリットル変位させることにより、ホルダーとシリンジを接続するチューブを介してコラゲナーゼを含むピペットに正圧を短時間加えます。

10〜15分後、残った神経上膜の破片が観察されたら、空のピペットに穏やかな陰圧を加えて破片を吸い取ります。このようにして、ニューロンと周囲の衛星グリア細胞がはっきりと露出し、パッチ記録の準備が整います。この手順では、劣化を防ぐために電極溶液を氷の上に置きます。

次に、ガラスパッチピペットにろ過された細胞内溶液を充填します。次に、ピペットをヘッドステージピペットホルダーに入れます。ピペットを入浴液に下げる前に、プランジャーを約1ミリリットル変位させることにより、5ミリリットルのシリンジを介してピペットに穏やかな陽圧を加えます。

続いて、アンプでV-Clampモードを選択し、ソフトウェアでメンブレンテストインターフェースを開きます。顕微鏡下で、ピペットをターゲットニューロンに近づけます。次に、ピペットから陽圧を加えてサテライトグリア細胞層を横切り、ニューロンとサテライトグリア細胞の周囲の層との間の空間の突然の拡大が観察されるまで

次に、ニューロンにくぼみが観察されるまで、ピペットをニューロンに向かって動かし続けます。私たちの準備では、ニューロンは衛星グリア細胞に囲まれています。したがって、グリア細胞層を貫通し、個々のニューロンに到達するために、記録ピペットは高い陽圧に維持されます。

その後、陽圧を下げます。やさしい吸引力でギガオームシールを実現。全細胞記録構成を得るには、短いが強力な吸引を介してニューロン細胞膜を貫通します。

または、ザップ機能を使用します amp吸引が適用されている間。全セルモードが確立されたら、アンプの静電容量と抵抗の補償ノブを回して、セル全体の静電容量と直列抵抗を補償します。次に、メンブレンテストウィンドウを閉じます。

I-Clamp のモードノブを回してノーマルモードを選択します amplifier。その後、ソフトウェアの[オープンプロトコル]をクリックします。レオベースを測定するためのプロトコルを選択してロードし、記録をクリックして記録を開始します。

ニューロンの興奮性を調べるには、100ピコアンペアのステップで段階的な一連の脱分極電流を注入することにより、入力抵抗とレオベースを測定します。次に、再度「Open Protocol」をクリックし、膜閾値を測定するためのプロトコルを選択します。続いて、ニューロンに500ミリ秒の脱分極ランプ電流を注入します。

リガンド誘導電流を記録するには、ピペットに特定のアゴニストを充填します。ピペットをチェックして、内部に気泡がないことを確認します。次に、薬剤分配システムに接続されているピペットホルダーにピペットを置きます。

マニピュレーターを使用して、ピペットをニューロンから15マイクロメートル以内に移動します。薬剤分配システムの圧力を 1 PSI に設定し、持続時間を 1 秒に設定します。次に、記録モードを電圧に切り替えますamp 70ミリボルトで。

薬剤分配システムを介して簡単に圧力をかけ、薬剤誘発電流を記録します。この図では、DRGニューロンに一連の電流を注入することでレオベースを測定しています。活動電位を誘導する可能性のある最低電流強度は、矢印で示されているようにレオベースとして定義されます。

このニューロンのレオベースは300ピコアンペアです。膜の閾値は、ランプ電流を注入することによって測定されました。電位は、活動電位が誘発されるときの膜閾値として定義されます。

このニューロンの膜閾値は11.9ミリボルトです。この図では、グルタミン酸またはAITCを1秒間パフ印加することで電流が誘導されました。両方のアゴニストは内向きの電流を誘導し、小さなDRGニューロンにグルタミン酸受容体とTRPA-1受容体が存在することを示唆しています。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば1時間以内に完了することができます。この手順を試みるときは、神経上膜を取り外し、記録ピペットの高圧を維持することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、サテライトグリア細胞の受容体やチャネルなどの追加の質問に答えるために、サテライトグリア細胞のパッチクランプ記録を実行できます。

この技術は、痛みの分野の研究者が侵害受容に対する後根神経節の寄与を研究する道を開きました。このビデオを見た後、あなたは全体の後根神経節を準備する方法と、次にこれらの全体の後根神経節の単一細胞からクランプをパッチする方法についてよく理解しているはずです。