ハイコンテンツインビトロ膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。

このハイコンテントβ細胞複製スクリーニングプラットフォームの全体的な目標は、β細胞の増殖を制限する分子経路の調査を促進することです。この方法は、ベータ細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、ベータ細胞の再生を制御する重要なシグナル伝達分子や経路の1つなどです。

この手法の主な利点は、スループットセルライニングを特定の評価に増加させ、一次島細胞複製の自動データアナリストを行えることです。この技術の採用は、糖尿病の再生医療の開発にまで及ぶ可能性を秘めています。私たちの社会に大きな健康と経済的コストをもたらす病気。

まず、22 ゲージの針を備えた 10 ミリリットルの注射器を装填した膵臓消化液を使用して、嚢胞性肝管と総肝管の接合部またはその遠位にある総胆管を化学化します。頭皮のハンドルで総胆管を支えながら、10ミリリットルの溶液をゆっくりと注入します。すべてのコラゲナーゼを投与した後、湾曲した鉗子とハサミを使用して、膨らんだ膵臓を下行する結腸、腸、胃、およびスプラインから分離します。

次に、5ミリリットルの膵臓消化液を含む氷上の50ミリリットルのチューブに最大2つの膵臓を置きます。すべての膵臓が採取されたら、消化チューブを摂氏37度の水浴に15分間入れ、3分ごとに穏やかに渦を巻きます。消化が終わったら、チューブを垂直に10回激しく振ってください。

そして、標本に10ミリリットルの冷間洗浄緩衝液を追加します。チューブをさらに5回激しく振って、氷の上に置きます。次に、チューブを最終容量50ミリリットルまで冷水洗浄バッファーで満たし、チューブを5回反転させます。

次に、組織を回転させ、ペレットが外れないように注意しながら、上清を注ぎます。組織スラリーを25ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁した後、穏やかなボルテックスを行います。スピニングと再懸濁の手順をさらに2回繰り返します。

組織懸濁液を30メッシュの組織ふるいを通して滅菌250ミリリットルのビーカーに注ぎます。消化チューブをさらに20ミリリットルの洗浄バッファーですすぎ、洗浄液をメッシュに注ぎ、未消化の膵臓組織と脂肪組織を取り除きます。ろ過した材料を2本の新しい50ミリリットルチューブに分割し、遠心分離により組織をペレット

次に、上清をデカントし、チューブを反転させて余分なバッファーを排出します。膵島を精製するには、膵臓組織ペレットに20ミリリットルの冷密度勾配を加え、5回静かに上下させて内容物を均一に再懸濁します。次に、10ミリリットルのHBSSをグラジエントの各チューブの壁にゆっくりと重ね合わせ、鋭い液体界面を維持し、遠心分離によって膵臓細胞を分離するように注意します。

10ミリリットルのピペットを使用して、界面から新しい50ミリリットルの円錐管に膵島層を移します。次に、40〜50ミリリットルの洗浄バッファーで膵島を3回洗浄します。チューブを反転させて、各遠心分離の間にペレットを再懸濁します。

最終洗浄後、チューブを組織培養フードに入れます。上清を吸引します。そして、ペレットを6ミリリットルの膵島媒体に再懸濁します。

各チューブからの膵島を6ウェル組織培養プレートの個々のウェルでふるいにかけます。そして、プレートを渦巻いて、井戸の中央にある小島を集めます。顕微鏡下で膵島の純度を評価します。

膵島をさらに精製するには、1ミリリットルのピペットを使用して膵島を回収し、6ミリリットルの膵島培地を使用して隣接する井戸に移します。純度が90%を超えるまで、膵島の旋回、収集、移送、顕微鏡評価を繰り返します。次に、膵島を20ミリリットルの膵島培地を含む単一の10センチメートル組織培養皿に移します。

すべての島が収穫されたら、培養皿を組織培養インキュベーターに一晩置きます。次に、384ウェルプレートのウェルに40マイクロリットルの804Gをコーティングし、ウェルごとに調整された培地をコーティングし、プレートをインキュベーターに一晩置きます。翌日、セルスクレーパーを使用して、小島をそっと取り外します。

次に、膵島を50ミリリットルのチューブに移します。遠心分離機で膵島を回収します。次に、20ミリリットルの温かいp、b、sでそれらを洗います。

1分間遠心分離します。上清を吸引します。そして、ペレットをゼロポイント2、5パーセントのトリプシンに再懸濁します。

1ミリリットルのピペットを使用して、膵島を摂氏37度で10分間インキュベートし、膵島を5分と10分で10回吸引して分注します。2回目のトレタレーションの後、トリプシン化された膵島細胞の20マイクロリットルのサンプルを数えます。組織が完全に消化されている場合は、解離性膵島細胞を4点で5倍10〜4細胞/ミリリットルの濃度で膵島機能培地に懸濁します。

次に、12ウェルマニホールドアスピレーターを使用して、事前に準備した384ウェルプレートから804Gコンディション培地を取り出します。そして、井戸ごとに70マイクロリットルの小島を、列4から21の行cからnにふるいにかけます。膵島を組織培養インキュベーターに48時間接着させます。

2日後、12ウェルマニホールドアスピレーターを使用して膵島培地を慎重に取り外し、12チャンネルピペットを使用して各ウェルに35マイクロリットルの膵島機能培地を追加します。次に、新たに調製した2つのx化合物溶液の35マイクロリットルを各ウェルに移します。そして、さらに48時間、膵島をインキュベーターに戻します。

48時間後、化合物処理した膵島培養物を固定、染色、および自動化されたハイコンテントイメージングプラットフォームを使用して分析します。典型的な実験では、DAPI、PD-1、およびインスリン陽性ベータ細胞の複製速度は、Ki-67を共発現するベータ細胞の割合によって決定されます。アルファ細胞の複製は、DAPI陽性、PD陰性、グルカゴン陽性、Ki-67共発現細胞の割合として測定されます。

例えば、この代表的な実験では、ジプリリダモールはβ細胞の複製を促進することが観察されましたが、α細胞の複製は促進しませんでした。この手法は7日で完了できます。この手順に従うと、ベータ細胞の複製において作用機序を明らかにするためにさらに研究できる化合物

この技術により、ベータ細胞生物学の分野の研究は、ベータ細胞の成長を調節する新しいシグナル伝達因子と経路を特定することを可能にしました。このビデオを見れば、小分子が選択的にベータ細胞の再生を刺激する能力をテストする方法についてよく理解できるはずです。