乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

ここでは、癌転移における肺胞マクロファージの機能を研究するためのモデルとアプローチについて説明します。転移におけるこれらの細胞の役割を実証するために、クロドロン酸リポソームによる肺胞マクロファージの枯渇と併せて乳がんの同系(4T1)モデルを使用しました。

これらの実験の全体的な目標は、乳がんのシンジェナイクスモデルを使用して、がん転移における肺胞マクロファージの役割を決定することです。この方法は、肺が最も一般的な標的の1つであるのが血液性がん転移である理由など、腫瘍免疫学およびがん転移分野における重要な問題のいくつかに答えることができます。この方法の主な利点は、肺胞マイクロファージの非常に特殊な方法で非常に確立された乳がんモデルを使用することです。

この手順を実証するのは、私の研究室の研究員であるSurya Kumari Vadrevuです。腫瘍細胞注射の日には、まず剃毛して麻酔をかけたマウスを手術用パッドの上に置きます。次に、PBSの100マイクロリットル中の腫瘍細胞を10〜5番目の腫瘍細胞に1回19回吸引し、29ゲージ針を備えたゼロポイント5ミリリットルインスリン注射器に吸引する。

次に、親指と人差し指を使用して2番目と3番目の乳首の近くの皮膚を持ち上げ、皮膚の下の針を3番目の乳首のすぐ下の乳房脂肪パッドに挿入します。細胞をゆっくりと皮下注射して皮膚の下に泡を形成し、動物が完全に回復するまで監視しながら動物をケージに戻します。接種後4〜5日で腫瘍を測定するために、腫瘍部位を触診し、ノギスを使用して腫瘍の最大直径と最小直径の両方を使用して腫瘍の体積を決定します。

注入した41GFP細胞をイメージングするには、麻酔をかけたマウスをイメージャー内の可動ステージに置き、蛍光顕微鏡で腫瘍部位をイメージングします。腫瘍細胞注射の6日後、ラミナーエアフローバイオセーフティキャビネットで、リポソームをボルテックスして粒子を均一に分散させ、60マイクロリットルの懸濁液を滅菌ピペットチップに吸引します。麻酔をかけた腫瘍接種動物の鼻孔の近くに先端を置き、5マイクロリットルのリポソーム溶液をゆっくりと放出し、マウスが滴を吸い込むようにします。

分娩中に動物が定期的に呼吸できるように、適切な麻酔レベルを維持しながら、リポソーム溶液をゆっくりと投与することが重要です。60マイクロリットル全体を投与したら、マウスが完全に回復するのを待って、動物をケージに戻します。肺表面の転移をカウントしてスコアリングするには、肺を解剖顕微鏡の下に置き、肺表面の明確なビューが得られるまで対物レンズ

次に、両肺の前面と後部のメタステーゼを手動でカウントし、蛍光顕微鏡で腫瘍を画像化します。転移をカウントして画像化した後、外科用ハサミと鉗子を使用して肺をミンチし、組織片を3ミリリットルの消化緩衝液を含む15ミリリットルの円錐管に移します。37°Cのインキュベーターで回転するシェーカーでフラグメントを40分間染色試験し、次にスラリーを粉砕して組織を解離させます。

次に、40ミクロンのストレーナーで組織懸濁液をろ過して塊を取り除き、必要に応じてシリンジプランジャーで大きなピースをストレーナーに押し込みます。単一細胞懸濁液が得られたら、遠心分離により細胞を回収し、赤血球をACKバッファーで室温で10分間溶解します。次に、ペレットを8ミリリットルのRPMIで2回洗浄します。

2回目の遠心分離後、細胞を3ミリリットルの完全RPMI培地に懸濁してカウントし、細胞を再度スピンダウンします。次に、細胞をFAXバッファー濃度100マイクロリットルあたり10〜6番目の細胞の1倍に希釈し、細胞の100マイクロリットルのeloquotesをV底96ウェルプレートの個々のウェルに移します。遠心分離によってウェルの底に細胞を回収し、プレートを裏返してバッファーを排出させます。

100マイクロリットルのCD16 CD32 FCブロックで細胞を摂氏4度で15分間ブロックし、プレートを再度遠心分離します。次に、プレートを裏返して、先ほど示したように上清を取り除き、目的の抗体カクテルを適切なウェルに加えます。摂氏4度で30分後、細胞を遠心分離してペレット化し、続いて200マイクロリットルのFAXバッファーで洗浄します。

次に、ペレットを200マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、サンプルを生存率色素で摂氏4度で20分間染色します。インキュベーションの終わりに、細胞をさらに200マイクロリットルのPBSで洗浄し、サンプルを100マイクロリットルの1パーセントパラホルムアルデヒドに固定して摂氏4度で保存します。解析の直前に、細胞懸濁液をポリプロペレンフローサイトメトリーチューブに移します。

乳腺脂肪パッドへの4T1GFP腫瘍細胞の注入は、肺内で観察される急速に形成される転移によって証明されるように、ヒト乳がんの転移性広がりを再現するマウス腫瘍の形成につながります。4T1細胞にGFPを安定的にトランスフェクションすることで、転移した腫瘍細胞の追跡と転移負荷の定量化が容易になります。ルーチンハストロジーは、デジタルパソロジーアルゴリズムと組み合わせれば、転移を定量化し検証するための優れたツールにもなります。

さらに、マルチカラーフローサイコメトリー分析により、CD11b陰性、CD11c F80陽性肺胞マクロファージなどの希少な細胞集団の特性評価も可能です。その枯渇は、ビクロトレネートは、リポソーム処理動物の解離肺にこれらのCD11c F480陽性細胞が存在しないことによって確認することができる。このビデオを見た後、乳房脂肪パッドに腫瘍細胞を注入する方法、腫瘍の成長と転移を監視する方法、肺胞マクロファージを枯渇させる方法、およびフローサイコメトリック分析のための肺細胞の準備方法についてよく理解できるはずです。