NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。

この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーベースのアッセイを使用してNK細胞の機能をモニターすることです。ナチュラルキラー細胞は、さまざまなウイルス感染や悪性疾患の結果に不可欠です。NK細胞の機能をよりよくモニターするために、私たちの研究室では、科学研究と臨床評価の両方に使用できるフローサイトメトリーベースのアッセイをさらに開発しました。

私たちは、小児科や免疫不全患者での使用に不可欠な小さなNK細胞サンプルサイズの分析を可能にするために、プロトコルを最適化しました。この技術のさらなる利点は、NK細胞集団全体だけでなく、異なるNK細胞サブセットでもNK細胞の機能を測定できることです。NK細胞を単離するには、まず、適切な量のNK細胞単離カクテル溶液を、患者からの6〜10ミリリットルのEDTA末梢全血と数回の逆転で混合します。

次に、チューブローテーター上でサンプルをさらに均質化し、室温で5分間加熱します。次に、チューブを無菌条件下で15分間磁気セパレーターに入れ、チューブラベルが磁石の後ろを向くように注意して、分離ラインの視認性を高めます。分離の終わりに、上清を新しい15ミリリットルのチューブに慎重に移し、完全な培地で最終容量を最大15ミリリットルにします。

細胞を遠心分離で洗浄し、ペレットを1ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、完全な培地中の100マイクロリットルあたり少なくとも2倍から4番目のNK細胞の濃度に体積を調整します。単離されたNK細胞を刺激するには、まず少なくとも5回ピペッティングして穏やかに混合し、100マイクロリットルの細胞を96ウェルV底プレートの適切なウェルに分注します。

照明を消し、NK細胞の各ウェルに抗CD107a抗体を添加します。次いで、K562腫瘍細胞のアリコートを、少なくとも5回ピペッティングすることにより、100マイクロリットル体積あたり10〜4番目の細胞の2倍で慎重に混合し、100マイクロリットルの腫瘍細胞を刺激のために計画された各細胞に移す。正確なピペッティングと1対1のエフェクターターゲット比の調製は、NK細胞の機能を正確に評価するために非常に重要です。

次に、IL-2とIL-15を刺激ウェルに加え、少なくとも5回ピペッティングしてすべてのウェルを混合します。光から保護されたプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。ライトを消した状態で最初の1時間後、調製したばかりのタンパク質輸送阻害剤溶液を各ウェルに慎重に混合し、プレートをインキュベーターに戻します。

インキュベーションの終了時に、共培養物を慎重に混合し、対応するフローサイトメトリーチューブに移します。遠心分離のために各チューブに1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、サンプルごとに99マイクロリットルのPBSと1マイクロリットルの固定可能な死細胞マーカーにペレットを再懸濁します。ボルテックスで細胞を混合し、続いて暗所で室温で15分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、細胞を1ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄し、ペレットを84マイクロリットルの洗浄バッファーと16マイクロリットルの適切な細胞表面抗体カクテルに再懸濁します。サンプルをボルテックスして混合し、暗所4°Cで20分間インキュベートします。次に、細胞を1ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの冷間固定溶液に再懸濁します。

ボルテックスで混ぜ合わせ、続いて暗闇の中で摂氏4度で10分間混合します。次に、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ペレットを90マイクロリットルの透過化バッファーに再懸濁します。10マイクロリットルの適切な細胞内抗体で染色し、ボルテックスで混合します。

4°Cの暗闇で30分間過ごした後、1ミリリットルの新鮮な透過化緩衝液で細胞を2回洗浄します。次に、サンプルを400マイクロリットルの新鮮な透過化バッファーに再懸濁します。ボルテックスでよく混合し、フローサイトメトリーによる分析まで細胞を氷上に置きます。

できるだけ早く、すべてのチューブをフローサイトメーターに移し、データ取得を開始してください。ここでは、NK細胞集団全体と3つの異なるNK細胞サブセットの脱顆粒、サイトカインおよびケモカイン産生を分析するためのゲーティング戦略を示します。健康なドナーからの刺激を受けていないNK細胞は、インターフェロンγもMIP-1ベータも産生せず、表面にCD107aを発現しません。

対照的に、腫瘍細胞とサイトカインで刺激されたNK細胞は、細胞内インターフェロンガンマとMIP-1ベータを大量に産生し、CD107a細胞表面発現が示すように、腫瘍細胞の相互作用により20%以上の細胞が脱顆粒を示しました。一度習得すれば、このテクニックは8時間で完了することができます。この手順を試みる際には、NK細胞とK562腫瘍細胞のプレーティングを正確に行うことが重要です。

選択したエフェクターターゲット比を維持するには、カウントをできるだけ正確にする必要があります。この柔軟な手順は簡単に変更できます。例えば、PBMC集団内のNK細胞を解析したり、異なる抗体を使用して他の目的のマーカーをチェックしたりすることができます。

このビデオを見れば、フローサイトメトリーベースのアッセイを使用してNK細胞を精製、刺激、標識し、その機能をモニターする方法を十分に理解できるはずです。ヒト細胞や標的細胞を扱う作業は潜在的に危険であり、この手順を実行する際には、適切な個人用保護具を着用するなどの安全予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。