ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

このモデリング手法の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの顎の開発によって経験される機械的環境をシミュレートすることです。この方法は、機械的負荷のパターンが時間の経過とともにどのように変化するかなど、筋骨格分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。そして、これらの負荷はどのように細胞の行動を刺激するのでしょうか。

この技術の主な利点は、機械的環境の文脈で遺伝子発現のパターンと細胞の挙動の変化を分析できることです。この方法は、骨格の発達に関する洞察を提供することができます。また、高等脊椎動物の骨格要素や心血管系など、機械的負荷を受ける他の生物学的構造にも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、用語とソフトウェアがエンジニアリングのバックグラウンドを前提としているため、苦労する可能性があります。骨格要素の形状を視覚化し、筋肉を定量化し、筋肉付着部の正確な配置を特定するには、骨格ミオシンとII型コラーゲンの適切な年齢で魚を免疫染色します。まず、魚の幼生を4%パラホルムアルデヒドとPBSで1時間固定します。

次に、PBT洗浄を2回使用して固定剤を洗い流します。次に、幼虫を50%メタノールとPBTで5分間脱水し、続いて100%メタノールで5分間脱水します。その後、幼虫は必要になるまで100%メタノールで保存できます。

必要に応じて、幼虫を50%メタノールとPBTで5分間再水和します。その後、PBTで5分間洗います。次に、氷上で0.25%トリプシンとPBTを使用して幼虫を5〜6分間透過化します。

その後、PBTで5分間洗い、PBT洗濯をさらに3回繰り返します。抗体を塗布する前に、幼虫を5%血清およびPBTで2〜3時間ブロックします。次に、ウサギ抗II型コラーゲンおよびマウス抗ミオシン抗体の推奨希釈液で幼虫を5%血清およびPBTとインキュベー

このインキュベーションを室温で1時間、または摂氏4度で一晩行います。一次抗体を塗布した後、幼虫をPBTで合計6回、1回の洗浄につき15分間洗浄します。PBTを洗浄した後、5%美容液とPBTブロックを1〜2時間塗布します。

次に、二次抗体を塗布し、今後は調製物をできるだけ暗闇に保ちます。蛍光標識された抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体を5%血清およびPBTで使用します。二次抗体を塗布した後、幼虫をPBTで6回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。

記載されているように染色された幼虫、または蛍光タグを発現する幼虫は、次のように共焦点顕微鏡を使用してイメージングできるようになりました。10倍の対物レンズと約2.5倍のデジタルズームを使用して、関心領域の共焦点画像スタックを撮影します。488ナノメートルのレーザーと561ナノメートルのレーザーを使用して、緑と赤のチャネルを励起します。

次に、1.3 ミクロンの z 平面間隔と 3 つの線平均を使用して、512 平方ピクセルの画像を撮影します。約100のzセクションがスタックを埋めます。データをTIFF画像スタックとしてエクスポートします。

TIFF画像スタックを開き、適切なソフトウェアですべてのチャンネルを表示します。軟骨チャネルを右クリックし、orthosliceを選択して作成します。次に、軟骨チャネルを右クリックして、[画像処理]、[スムージングとノイズ除去]を選択し、画像フィルターを選択して、スムージングガウスを切り替えます。

プロジェクトビューで、フィルタリングされた画像を右クリックして[画像のセグメンテーション]を選択し、新しいラベルを編集します。軟骨や関節などの素材ごとに新しいラベルを作成します。次に、すべてのスライスのトグルをオンにした魔法の杖ツールを使用して画像の軟骨領域を選択し、ブラシツールを使用してアウトラインからノイズを除去します。

次に、ブラシツールで関節領域を選択し、それを関節コンポーネントに割り当てて、関節全体でアクションを繰り返します。一度に複数のスライスをスムージングするには、トップメニューから「セグメンテーション」を選択し、「ラベルをスムージング」を選択します。次に、コンポーネントの 3D サーフェス レンダリングを生成するには、画像を右クリックして [Generate Surface] を選択します。

次に、レンダリングされたサーフェスをクリックし、メッシュ生成用のデータをHMASCIIファイルとして保存しますsoftware. 3Dメッシュ生成は、優れたモデルを生成するための重要なステップです。モデル化しようとしている構造の実際の形状を表すメッシュと、角度が小さすぎる要素や大きすぎる要素など、問題のある要素を導入するほど詳細を含めないように、妥協する必要があります。

メッシュを生成するには、3Dモデルを対応するソフトウェアパッケージにインポートします。軟骨と関節表面の 2 次元メッシュを生成するには、2D メニューのシュリンクラップ ツールを使用します。1.5 から 2.5 までの要素サイズを選択します。

3Dメッシュの最適化を実行するために、さまざまなサイズのサーフェスメッシュを作成できます。メッシュがジョイントサーフェスと軟骨サーフェスの間で連続していることを確認するには、境界上のすべての要素が共通の節点を共有する必要があります。これを実現するには、ジョイントの内面を取り外し、中空のチューブを残します。

F2ファンクションキーを使用して、[要素の削除]メニューへのショートカットにアクセスします。削除する要素を選択します。境界ノードを軟骨表面に合わせて調整します。

F2、F3、およびF6ファンクションキーの組み合わせを使用して、それぞれ節点の削除、移動、および新しい要素の作成を行います。最後に、コレクターのコンポーネント整理メニューを使用して、関節の軟骨表面を複製します。F2 ファンクション キーを使用して、ジョイント以外の要素をすべて削除します。

その後、[Check elements] パネルに移動して品質チェックを実行します。メッシュ内の重複した要素、挿入、および貫通を確認します。見つかった場合は、[ツール] タブを使用して編集します。

二面角は、モデルツリーオプションにあるユーティリティタブを使用して確認します。異なる要素サイズの2Dサーフェスメッシュから3Dメッシュを生成するには、Tetrameshツールを使用します。異なるメッシュサイズを比較し、メッシュサイズが最も小さいFEモデルを選択します。このFEモデルは、さらなるシミュレーション後に収束し、フィーチャー定義を損なうことはありません。

次に、距離ツールを使用して、顎モデルがスケーリングされるようにメッシュを変換します。軟骨と関節のコンポーネントがモデル内で接続されていることを確認するには、結合されたモデルをエクスポートするか、タイを使用します。次に、荷重、拘束条件、および材料特性をFEモデルに適用して、ジョー関数をシミュレートします。

ラベル付けされた共焦点スタックをガイドとして使用して、筋肉を定義します。まず、筋肉の付着点に対応するノードを割り当てます。次に、各筋肉の原点と挿入を表すベクトルをノード間に作成します。

すべてのMuscleを定義したら、履歴ロードコレクターを作成し、各MuscleにCloadを適用します。大きさをニュートンで指定し、関連するベクトルを割り当てます。次に、文献で決定されているように、適切な弾性等方性材料特性を割り当てます。

次に、境界荷重コレクターを作成し、モデルにいくつかの初期拘束条件を適用します。拘束する節点を選択し、それらの節点によって定義される筋肉の自然な運動範囲に類似した自由度係数を選択します。次に、シミュレートする動きのタイプごとに荷重ステップを作成します。

解析メニューの下で、関連するすべての荷重と拘束条件を選択して、指定されている動きをシミュレートします。次に、ドロップダウンメニューから[静的]を選択します。準備ができたら、メッシュ、荷重、拘束、材料特性など、適切なファイル形式でモデルをエクスポートします。

この場合、INP 形式が選択されます。次に、モデルをFE解析ソフトウェアに読み込みます。そこで、モデルのジョブを作成して実行し、応力、ひずみ、変位などの出力を解析します。

トランスジェニックゼブラフィッシュの幼生を3〜6匹選択し、0.02%MS-222で幼虫を軽く麻酔します。触れても反応が止まるまで、しかし心臓はまだ鼓動しています。次に、幼虫をダニオー溶液中のぬるま湯の1%低融点アガロースのカバースリップに横向きに取り付けます。次に、鉗子で頭と顎の周りからアガロースを慎重に取り除きます。

次に、パスツールピペットを使用して、新鮮なダニオー溶液を幼虫の頭に洗い流し、麻酔薬を取り除きます。通常の口の動きが戻るまでこれを行います。次に、動画キャプチャソフトウェアを使用して、口の動きを蛍光表示の高速ビデオを撮影します。

複数のジョーオープニングサイクルを記録するために必要な限り、最高のフレームレートで撮影します。後で、ジョーの最大変位を分析します。顎が最も広く開いているフレームを選択し、メッケル軟骨の前方先端と上顎の間の距離を測定します。

上顎の点は篩骨板の先端に対応しています。筋肉や軟骨の免疫染色、またはトランスジェニックレポーターのイメージングにより、顎の3D構造と関連する筋肉組織を視覚化できます。高解像度でイメージングすることで、顎の3次元形状を捉えたモデルを構築することができました。

このモデルには、筋肉と軟骨の共焦点画像から導き出された配置と大きさの負荷が組み込まれています。このモデルから、さまざまな材料特性がテストされました。高速動画撮影で得られるin vivo変位を活用し、その可動域を最もよく再現したモデルを1つ選びました。

最も正確な材料特性、荷重、およびメッシュ形状データを使用して、FEモデルを使用して、この時間枠で経験した機械環境の最適な推定値を調査しました。たとえば、応力の大きさが測定されました。モデルを拡大してパターンの細部を確認し、デジタルセクションで見て、すべての次元で詳細を観察できます。

このビデオを見れば、共焦点イメージングを使用して、機械的負荷がかかる生体構造の生理学的に正確な3Dモデルを構築する方法について十分に理解できるでしょう。この手順を試行する際は、これが線形の弾性モデルであり、軟骨が完全に線形材料として動作するわけではないことを覚えておくことが重要です。透過性などの他の材料特性を組み込むことができますが、メッシュにさらに変更を加える必要がある場合があります。