Name: ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: 学ぶ有限要素解析を用いたゼブラフィッシュ顎のバイオメカニクスシミュレーション手法。コンフォーカル顕微鏡と3Dメッシュ生成で機械的環境を可視化し、骨格発生と細胞挙動の関係を解明する計算モデリング技術です。

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LHBは、ウェルカム・トラスト動的セルの博士課程のプログラムによって資金を供給されました。 KARは、MRCプロジェクトの助成金によって賄われていたMR / L002566 / 1（EJR及びCLHに授与）とCLHは、我々はまた、イメージング・アドバイスウォルフソンバイオイメージング施設に感謝したいと思いARUKグラント19479.によって賄われていました。

プロトコル内のすべてのステップは、ブリストル大学の動物のケアの福祉ガイドラインや英国内務省のものに従ってください。 筋骨格解剖学の1可視化注：筋肉を定量化するために、筋肉の添付ファイルの正確な配置を識別するために、骨格要素の形状を可視化するために、免疫染色（セクション1.1）（筋肉を明らかにする）骨格筋ミオシンのための適切な年齢で魚やII型コラーゲン（可視化します軟骨）。筋肉の添付ファイル（1.2節）の位置を視覚化するために、GFP 15：軟骨と遅いミオシン重鎖レポーターsmyhcを可視化するためにmCherryを13,14：別の方法として、例えば、コラーゲンa1のレポーターCOL2A1トランスジェニック蛍光レポーターラインを使用して、筋骨格解剖学を視覚化します。 軟骨や筋肉をマーク代替行が等しく十分に仕事ができます。 <ol><li> 蛍光Immunostaining <ol><li> 1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、過剰の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で幼虫を固定します。 0.1％のTween 20（PBT）を含むPBSで洗浄し、それぞれ5分間、PBT中の50％メタノール（MeOH）で100％MeOHに脱水。 注意：PFAは毒性があり、材料安全シートに従って処理する必要があります。 注：必要になるまで幼虫が100％MeOH中に格納することができます。 </li><li> 5分間PBTに50％MeOH中の幼虫を再水和。 5分間PBTで洗浄します。 </li><li> 5-6分間氷上でPBTで0.25％トリプシンで幼虫を透過性。 5分ごとに4倍PBTで洗います。 </li><li> PBTの5％血清中で2-3時間ブロックします。 </li><li>室温でまたは一晩4℃で1時間、PBT中の5％血清中のウサギ抗2型コラーゲンとマウスの推奨希釈抗ミオシン抗体で幼虫をインキュベートします。 注：推奨される希釈範囲は、抗体のデータシートに通常です。互いに異なる種に対して惹起されたとのこともdiffeされている抗体を選択してください組織に借ります。 </li><li> PBTで15分間幼虫の6倍を洗ってください。 </li><li> PBTの5％血清中で1〜2時間ブロックします。 </li><li>暗闇の中で二次抗体でインキュベートします。特定の抗体のための5％血清およびPBT中の適切な希釈で蛍光標識した抗マウス（550）および抗ウサギ（488）二次抗体を使用してください。 </li><li>できるだけ早く10X共焦点顕微鏡上のPBTと画像内の各10分間洗浄6X。 </li></ol></li><li> イメージング筋骨格ジオメトリ <ol><li> Danieauの溶液16中のぬるい0.3から0.5パーセントの低融点（LMP）アガロース中のカバースリップ上で腹側幼虫をマウントします。 注：トランスジェニック魚は、装着前と撮像中に0.02％MS222（トリカインメタンスルホン酸、pHが7）で鎮静される必要があります。 </li><li> 10倍対物レンズと、約2.5倍デジタルズームを使用して、関心領域の共焦点画像スタックしてください。 488 nmおよび561のnを使用して、緑と赤チャンネルの画像を用意mはそれぞれレーザーです。 1.3ミクロンと3ライン平均値のZ面の間の間隔が512×512ピクセルの解像度での画像。結果のスタックは約100 zのスライスで構成されます。 </li><li> tiffのシリーズとしてデータをエクスポートします。 5dpfゼブラフィッシュ幼虫から筋肉および軟骨の要素の最大投影は、図1に示されています。 </li></ol></li></ol> 2. 3Dサーフェスの生成<ol style="margin-left: 40px;"><li> 3、4、5、DPFの各時点での代表的なデータセットを選択してください（複数のサンプルの可視化の後に選択します）。 </li><li> 3次元tiffのスタックを開き、解析ソフトウェアのすべてのチャネルを選択します。右軟骨チャンネルをクリックして、画像フィルタと平滑化を選択：ガウス（ 図2B）。 </li><li>プロジェクトビューで右フィルタ処理された画像を上にクリックして、「画像分割」を選択し、「新しいラベルを編集します」。各材料、 すなわち、軟骨とjのための新しいラベルを作成します。OINT。魔法の杖ツールを使って画像の軟骨領域（ 図2C、白信号、紫色のアウトライン）を選択します。アウトラインからノイズを除去するブラシツールを使用してください。 注：魔法の杖ツールを使用している場合、「すべてのスライス」をクリックします。 </li><li>ブラシツールと共同で地域を選択して、関節構成要素に割り当てる（ 図2C、青のアウトライン） </li><li>トップメニューと滑らかなラベルでセグメンテーションを選択することにより、一度に滑らかな複数のスライス。右の画像をクリックして、3D表面は、コンポーネント（ 図2D）のレンダリング生成するために表面を生成する]を選択します。 </li><li>面をクリックして、メッシュ生成ソフトにインポートするhmasciiファイルとしてデータを保存します。 </li></ol> 3. FEモデルで使用される筋力の計算<ol style="margin-left: 40px;"><li> smyhcの共焦点画像からの筋線維の数を数える：GFPトランスジェニックゼブラフィッシュ（ 図1A、矢じり、1C）とDIAMを測定繊維の計は、その断面積を計算する（πR2）。 </li><li>文献からの筋肉単位面積あたりの適切な力を識別します。幼生ゼブラフィッシュ骨格筋（40 nNの個/μm2）の単位面積当たりに発生最大筋力17を使用しました。 </li><li>単位面積当たりの力によって繊維の数とその面積を乗じて各解剖学的筋肉群のための力を計算します。 表1を参照してください。 </li></ol> 4.メッシュの生成<ol style="margin-left: 40px;"><li>有限要素メッシュを生成することができるソフトウェアパッケージにセクション2（上記）で生成された3Dモデルをインポートします。 </li><li> 2Dメニューのシュリンクラップ・ツールを使用して、軟骨および接合面のA2Dメッシュを生成します。適切な要素サイズを選択します。 注：1.5から2.5の間の要素サイズを使用します。必要に応じて、異なるサイズの2次元面の範囲を生成する3次元メッシュ最適化（セクション4を行うことが噛合しています。4）。 </li><li> &#39;&gt; 2D&gt;ツール要素チェック]の下にあるメッシュ品質チェックを行うメッシュ内の重複した要素、挿入および貫通をチェックするためのパネルを。モデルツリーでユーティリティ]タブを使用して二面角を修正しました。 </li><li> 3D&gt; tetrameshをサブパネルを使用して、要素の大きさの異なる2次元表面メッシュから3Dメッシュを生成します。 注：異なるメッシュサイズの結果を比較し、さらにシミュレーション後に収束し、機能の定義を損なわない最低のメッシュサイズでFEモデルを選択します。 図3の例では、下顎軟骨のための150万四面体要素が含まれており、2.0の2D要素サイズを有していました。 </li><li>顎モデルはジオメトリ&gt;距離のサブパネルを用いた共焦点スタックごとにスケールすることですので、メッシュを変換します。 注：軟骨を確認して、関節構成要素がマージされたモデルをエクスポートすることにより、またはタイを使用してモデルに接続されています。 </li></ol> 5.有限要素のModエル建設<ol><li>商業有限要素（FE）ソフトウェアを使用して、FEモデルを作成します。ガイドとしてセクション1で生成された共焦点スタックをラベルされた3Dの筋肉や軟骨を使用して、筋肉の付着点に対応するノードを割り当てます。各筋肉（ 図3）の起源と挿入を表す2つのノード間のベクトルを作成します。 </li><li>各筋肉のための &#39;C・ロード」を適用するタイプの歴史」のロードコレクタを作成します。 （ステップ3.3で計算）ニュートンで大きさを指定し、関連するベクトルを割り当てる。 図3は、内転下顎（AM）、分度器hyoideus（PH）とintermandibularis（IM）のための接続点を示しています。 注：これらの顎の筋肉の場合、最大の収縮力は、各負荷の50％のみが、各サイトで適用されるように、原点と挿入の間に分配されます。 </li><li>文献によって決定されるような適切な弾性等方性材料特性を割り当てます。軟骨のためのヤング率このモデルではゾーン間はそれぞれ1.1 MPaの0.25 MPaであったとポアソン比は両方18,19のために0.25でした。 </li><li>モデルの初期の制約を適用するタイプ &#39;境界」のロードコレクタを作成します。タブの分析&gt;制約に移動して、作成サブパネルで、あなたが制約したいモデル上のノードを選択します。その動きの自然な範囲の最良の近似にモデルの動きを制限する自由（DOF）の度を選択します。 注： 図3のモデルは、動きの全ての軸に拘束したモデルでとで中間点に空間にそれを固定する舌骨角の時（DOF 1、2、3はそれぞれx、yおよびzを表します） palatoquadrateはゼブラフィッシュ頭蓋の残りの部分に接続する時点でy及びz軸（ 図3、 表1）。モデルは、1つ以上のノードにすべての3つの自由度に制限される必要があります。 </li><li>あなたはサイマルしたい運動の種類ごとに、「ロード・ステップ」を作成します。分析メニューの下で、（ すなわち、開口部、閉鎖を）食べて、この動きをシミュレートするために、（5.4節で行われた）と制約（セクション5.2で行われた）関連するすべての負荷を選択します。それが表示されたら、ドロップダウンメニューから「静的」を選択します。 </li><li>この場合には、メッシュ、荷重、拘束と適切なファイル形式の材料特性などの輸出モデル、「.INP」形式。 </li><li> FE解析ソフトウェアへの負荷モデル。ジョブモジュールを使用して、モデルの仕事を作成し、実行します。 </li><li>結果タブと可視化メニューにあるなど 、応力、ひずみ、変位、のための出力を分析した （ 図4および5）。 </li></ol>顎変形/変位距離の6検証<ol><li>トランスジェニックゼブラフィッシュ：3-6のTg（mCherryをCol2a1aBAC）を選択します 。 </li><li>彼らは触れることなく、彼らの心はまだ鼓動している回答するのをやめるまで軽く0.02％MS222との幼虫をanaesthetize。 </li><li>マウント横方向にぬるい1％LMPアガロースでカバースリップ上（麻酔をかけながら）（Danieauの溶液中に作られた）の幼虫。 </li><li>鉗子で頭とあごの周りからアガロースを削除してください。 </li><li>通常の口の動きが再開されるまで、パスツールピペットを使用して麻酔を除去するために、幼虫の頭の上（無MS222付き）新鮮Danieauのソリューションをフラッシュします。 </li><li>口の動きの明視野高速ビデオを撮影する動画キャプチャソフトウェアを使用してください。最も高いフレームレートで1分の持続時間の周りの映画を撮る、または十分な顎の開口部の複数のサイクルを記録します。 </li><li>その最大変位にオープンジョーを表示するフレームを選択してください。 μm単位でメッケル軟骨および上顎（篩骨プレートの先端）の前部先端との間の距離を測定します。 </li><li>複数の稚魚からの平均変位を計算します。 </li><li>モデルから変位データを抽出します。 （モデル変位の挙動を確認するために、6.8で算出した平均変位を使用します<stronグラム&gt;図4）。モデルが予想から外れる場合は、順次材料特性と筋肉の負荷を変化させることによって、感度分析を実行します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。 図3-5のいくつかのデータはJ.Biomech、48（12）、ブラントらから再版された、有限要素モデリングが原因で顎の開発、3112から22で筋肉の緊張の損失に接合形状と細胞の挙動の変化を予測します。 2015年、エルゼビア15からの許可を得て。

有限要素モデルは、骨形成10を受けるものと緊張下にある骨格要素の領域を関連付けるために、ならびに軟骨内骨化や関節の形態形成8,12,21時のひずみの下の領域をマッピングするために使用されてきました。他の研究はまた、共同開発11,12の間に変更を複製するための理論的な成長モデルを適用することができました。ここでは、比較的単純なシステム、ゼブラフィッシュ顎20のためのFEモデルを構築するためのプロトコルを示します。複数の組織を研究するために、このようなCTスキャン22、トランスジェニック系統の共焦点イメージングまたは免疫染色ゼブラフィッシュなどのFEモデルのための生の画像を収集する別の方法とは異なりできます。それは、したがって、軟骨に関連する筋肉の接続点に直接情報を提供することができます。脊椎動物のモデルの中ではゼブラフィッシュは、遺伝的および薬理学的操作に特に適しています。ゼブラフィッシュのためのFEモデルの生成頭蓋顔面の軟骨は現在、関節の形態形成におけるバイオメカニクスと遺伝学の間の相互作用のさらなる研究の可能性を開きます。 FEモデルを作成するプロセスの重要なステップの数があります。まず、システムの正確な三次元表現を生成しています。これは明らかに境界を定義するために十分な高解像度で撮影する必要があります。でも、高分解能イメージングとの良好な一面は、いくつかの領域を平滑化する必要があるかもしれ作ることに注意してください。もう一つの重要なステップは、負荷と正しい制約の正しい配置を定義しています。不十分な制約モデルは、解決に失敗し、負荷の不正確な配置は、異常な動きの原因となります。 生データから生成された表面（ 図2B）をメッシュすることが困難であるように、生データのいくつかの処理（ 図2）が必要です。我々は、ガウスフィルタを使用してデータ（ 図2Cを濾過しました</strong&gt;）、我々は3D表面に変換することができるきれいなアウトラインのセットを生成するために、曲線のいくつかの手動の平滑化を行いました。あまりにも多くの平滑化は、その機能の多くを失った「溶融」表面を生成することができます。小さすぎる要素サイズを選択すると、計算集約的である大きすぎるメッシュを作成するように正しい要素サイズを選択すると、反復的なプロセスです。しかし、あまりにも大きな要素サイズを選択すると、構造の正確な形状を再現するために失敗したメッシュを生成します。正しいメッシュは顎の正確な形状を捕獲し、正解に収束、顎の変位を用いて検証最小の要素サイズを有していました。また、異なる年齢及び種は実質的に異なる特性を有するように、より良い正確な変位をエミュレートするために、材料特性や負荷の計算を変更する必要があるかもしれません。 常に仮説モデルであり、aには限界があることを覚えておくことが重要ですssumptionsはFEモデルを実行するために作られました。 1つまたは少数のサンプルをモデル化する際には、個人間の小さな変動である可能性があるように代表的なサンプルが選択されることを確実にするために重要です。唯一の顎要素と筋肉の一部が含まれていたように、モデルは、ゼブラフィッシュ頭蓋顔面筋骨格系の簡易版です。そのため、制約は、モデル化された顎要素が頭蓋骨の残りの部分と接続する場所を考慮して配置されるように持っていたモデルは、人工的に「スペース」でそれを修正するために中央に拘束されました。この人工的な制約は、それ自体が分析されていなかった舌骨角のようなモデルから引き出された解釈に影響を与えませんでした。頭蓋顔面構造のより多くを含めることは、そのようなsternohyals及びその添付軟骨23、として特に他方のジョー開く筋肉がモデルに追加されたかもしれないが、制限は、有限要素ソフトウェアで実行する大きなモデルの機能が含まれています。 S = &quot;jove_contentは&quot;&gt;別の制限は、これは、ばね8を挿入することによって達成することができるものの、我々は、靭帯の挿入をモデル化していないことです。この場合には作られたもう一つの仮定は、モデルが直線的に振る舞うというものでした。モデルの株の大きさは、発行されたモデルのものと同等であったと株が3500を下回ると制約と筋肉の付着点から離れ-5000μɛの上にあることで、in vitroでの細胞10,24に適用されます。したがって、モデルの関連領域での株は線形モデルの許容範囲内にあると考えられました。軟骨は、線形材料として完全に動作しないと、以前のモデル25内の流体挙動の分析を可能に多孔質弾性材料としてモデル化されています。ローカルノードのクラスタ間で筋肉の付着点を拡散することは、ピーク力を分配し、より正確に特定の筋肉のための筋肉の挿入を表すことになります。 ENT &quot;&gt; FEの使用は、構造に作用するひずみと応力の評価を可能にする。それは頻繁に整形外科、古生物学、より最近では発生生物学を含む多くの生物科学分野で用いられている技術として。ここでは、ゼブラフィッシュのためのFEを構築する方法について説明します下顎。将来的にはこれらのモデルは、口蓋を含め、全体の顎を見て拡張することができる。同様の技術は、現在までにほとんどが動によって研究されてきた魚で脊椎の生体力学をモデル化するために使用することができます。

有限要素（FE）モデリングは、計算構造体1に作用するひずみの大きさと位置を計算し、マッピングすることができ工学的手法です。このモデルは、「有限要素」のメッシュで表される立体構造で構成され、分析の最終結果は、メッシュ、機械の大きさや位置の要素の構造及び数を含む多くの因子によって支配されます負荷や材料特性。材料特性は、負荷の与えられたタイプの下で、材料の挙動の特定の側面を説明します。試料を延伸したときポアソン比は、その長さの材料の幅の比例的減少を説明しながら、ヤング率（E）は、材料の弾性を記述する。 FEモデルは、「アカウントに構造に関する固有の入力データを取ることによって、モデルに作用する変位、応力、圧力、歪みなどの変数のさまざまを計算することができます; sの形状、位置、および負荷の大きさと特定の材料特性。 FEモデルは、広く工学2にますます3整形外科及び古生物学アプリケーション4のために使用されます。開発中の生体力学的力は、細胞応答5-8を活性化する多くの細胞における刺激として作用することが知られており、臓器システムを開発中での相対的な位置および機械的刺激の大きさの両方を予測するために有用であるが、現在、FEモデルはほとんど使用されていますゼブラフィッシュの開発のため。 軟骨および骨の両方が機械受容性材料であることが示されています。例えば、 インビトロでの圧縮は、張力が骨形成9のために必要であることが示されている一方で、軟骨形成経路を活性化することが見出されています。 FE解析（FEA）は、foの骨の間に骨格要素に作用するものを含め、生物試料に作用する菌株をモデル化するために利用されてきましたrmation 10。他の開発アプリケーションは、それが理論的な生体力学的な力11,12にさらされた後の関節の形状を予測するとひよこ膝関節の形態形成8の間に存在する株のパターンを表示するために、その使用を含みます。 このプロトコルは、開発組織の力学を理解することを視野に入れて共焦点画像から3次元サーフェス、メッシュおよび有限要素モデルを生成するの経験を共有することを目的としています。我々はまた、 生体内での実関節変位情報を取り込むのにFEモデルを検証する方法を示しています。我々は模範としてゼブラフィッシュ顎を使用しながら、同じ技術は筋骨格系の構造の3次元情報を、共焦点又は多光子イメージングにより得ることができるため、任意の小さな生物学的システムで使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>II型コラーゲン抗体 - すべての軟骨を染色</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>発達研究 ハイブリドーマバンク</td><td>A4.1025</td><td>骨格マイソイン抗体 - すべての骨格筋をマークします&nbsp;</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>ゼブラフィッシュ</td></tr><tr><td>MS222 (エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)</td> <td>Σ</td><td>E10521-10G</td><td>麻酔薬を作るため</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>フィッシャー</td><td>T/3760/48</td><td>サンプル透過</td></tr><tr><td>ダイライト 488 マウス IgG</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35502</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ダイライト 550 ウサギ IgG</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>84541</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE 共焦点</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td>イメージング用&nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leicaキャプチャソフトウェア</td><td>Leica</td><td></td><td>Imagingソフトウェア</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D画像解析ソフトウェア (Section 2)</td></tr><tr><td>Hyperworksパッケージの一部Hypermesh(バージョン10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FEモデル生成ソフトウェア (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE解析ソフトウェア (Section5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

骨格の形態形成は、発生中に厳密に制御された細胞の振る舞いを通じて起こります。多くの細胞タイプは、機械的な緊張に応答してその振る舞いを変化させます。骨格関節は動的な機械的負荷を受けます。有限要素解析(FEA)は、材料や構造が機械的な入力にどのように反応するかを予測できる計算手法であり、エンジニアリングでよく使用されます。システム全体(この場合はゼブラフィッシュの顎の骨格)を小さな「有限要素」のメッシュに分割することにより、FEAを使用して、外部荷重に対する構造の機械的応答を計算できます。結果は、最大主ひずみと最小主ひずみの位置を示す「ヒートマップ」など、さまざまな方法で視覚化できます(正の主ひずみは引張を示し、負の主ひずみは圧縮を示します。最大値と最小値は、最大株と最小株を参照します。これらは、顎のどの領域、したがってどの細胞が顎の動き中に特に高い張力または圧縮負荷を受ける可能性が高いかを特定するために使用でき、したがって、機械的ひずみと細胞の挙動との関係を特定するために使用できます。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの下顎を実例として、筋骨格系の共焦点画像データから有限要素モデルを生成する手順を説明します。このプロトコルは、1)筋骨格系コンポーネントの染色、2)筋骨格系コンポーネントのイメージング、3)3次元(3D)表面の構築、4)有限要素のメッシュの生成、5)FEAの解決、最後に6)魚の顎の動きで見られる実際の変位と比較することにより結果を検証するという一連のステップを通じて読者を導きます。

筋肉（ 図1A）および軟骨（ 図1B）、またはトランスジェニックレポーター（ 図1C）のイメージングのための免疫染色は、顎の3D構造は、関連する筋肉組織とともに、可視化することを可能にします。高解像度で画像化することにより、顎の三次元形状（ 図2）と位置と負荷の配置（ 図3）の両方を捕捉するモデルを構築することが可能でした。高速ビデオキャプチャを通して見たin vivoでの変位（ 図4） に活用し、我々は、モデルの動きの範囲が現実的な範囲内であったことを確認しました。 実行するとFEモデルは、このような応力（ 図5A）、最小および最大主ひずみ（ - K 図5B）のようなデータの範囲を表示するために使用することができます。これらの結果は、3次元のあります<html> 5I、5I &#39;、&#39; &#39;、5E&#39;（図5E関連するビュー（ 図5F、5G、5J、5K） を得るために回転させ、デジタル切片（ 図 5E、5I）モデルは、細部の微細パターンを見るために拡大することができますので、ensional &#39;&#39;）を表示する方法を説明したモデルを通じて、応力、ひずみや圧力変化のパターン。モデル（図示せず）からの定量的データを抽出することも可能です。モデルを検証し、最も正確な材料特性を使用することにより、負荷および形状をメッシュFEモデルの開発の窓の間に細胞によって経験される機械的な環境の最良の推定値を探索するために使用することができます。モデルの結果は、直接細胞挙動と遺伝子発現の20の変化と比較することができます。 <html> 1再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：5 DPFでのゼブラフィッシュ下顎の筋骨格系の要素の代表的な画像 5dpf幼虫の下顎の代表的な共焦点スタックは、すべてのすべての骨格筋ミオシンを染色A4.1025の免疫染色トップに前方（A）（B）で示しますトランスジェニック記者のCOL2A1を表現するライブ幼虫からすべての軟骨（C）スタックをマークII型コラーゲンの免疫染色：GFP遅筋（緑）：mCherryを軟骨（赤）とsmyhcをマーク。 IA：intermandibularis前部、PH：分度器hyoideus、AM：転下顎、HI：hyoideus HI、劣っ：hyoideus優れ、CH：胸骨舌骨筋、MC：メッケル軟骨、PQ：Palatoquadrate、CH：舌骨角のは、 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。</a> 「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> 図2： 共焦点データから3D表面の世代接合部の高倍率とゼブラフィッシュ下顎のための3D表面への共焦点データから遷移を示す画像。 （A）生共焦点データ。ガウシアンフィルタの適用後（B）データセット。 （C）フィルタ処理概要; （D）3D表面が。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> 図3： 制約と力のベクトルを示す代表的メッシュ （A）、口閉鎖と5 DPFの幼虫のための代表的なメッシュ。（B）口の開口部。白丸は、モデルが制約された場所を表し、ここでの寸法（ 例えば、XおよびYまたはX、YおよびZ）。白い線が白い矢印で示される筋力のベクターを用いて、筋肉の位置を示します。レッドは、軟骨やイエローゾーン間を示します。この図は、以前ブラントら 15に発表された補足資料から変更されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> 図4： 感度試験 FE-モデルが異なる軟骨およびゾーン間のヤング率のため5dpfゼブラフィッシュで顎変位をシミュレートします。 （ミクロンで閉じに開放）顎変位が顎にマークされています。カラーキーを使用して記録しました。各モデル（- L）が異なる軟骨の組み合わせ（C = 1.1、3.1、または6.1メガパスカル）またはゾーン間（0.25、0.5、0.75、または1 MPaでのI =）特性を有しています。 、すなわち 、水平方向の黒い矢印が（黒い縦の矢印で示す）メッケル軟骨の先端に顎変位の値を強調しています。5のビデオからMとNの静止画幼虫示す最小DPF、すなわち、顎は（M）を閉鎖し、最大重ね合わせた2（O）と（N）は、完全にオープンジョー- O上の白い線は（43ミクロンの）変位を表します。この場合、0.25（A）ベストマッチのゾーン間で1.1の相対的な軟骨特性活魚（O）で見られる変位。 ALこの図のパネルは、以前ブラントら 15で公開されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のイオン。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> 図5：FEモデルからの代表的なデータ 5 DPFの幼虫に適用されるすべての筋肉のFE-モデルシミュレーション（A - C）。 （A）ミーゼス（EMaxmin）（B）最小主ひずみ（E最小P、μɛ）（C）最大主歪（Eマックス。P.、μɛ）。顎の開口部の間の最大値と最小主ひずみのFE-モデルシミュレーション。 （D - K）：最大主歪（EマックスP.、μɛ）（D）腹側顎図、（E）腹側ジョイントビュー（E）内はメッケル軟骨を通して近位-遠位セクションの位置を示しジョイントとゾーン間（E &#39;）及び（E&#39; &#39;）において、それぞれ。 （F）：横顎ビュー。 （G）：横方向の関節ビュー。 （H - K）：最小主ひずみ（EミンP、μɛ。）中の（H）腹側顎図、（I）腹側ジョイントビュー。 （ 私は ）メッケル軟骨ジョイントを介して近位-遠位セクションの位置を示しており、（I &#39;）および（I&#39; &#39;）は、それぞれ（J）でのゾーン間：横顎ビューを。 （K）：横方向の関節ビュー。この図は、以前ブラントらに掲載されました。15。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td>筋線維の数</td><td>筋線維面積（ 平方 μm） </td><td>筋肉群の面積（μmで2） </td><td>力（N） </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis前方</td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF分度器hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF内転筋下顎</td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> 表1： 筋肉の定量化。40 nNの個/μm2（参照17から採取された単位面積あたりの値）を使用して、DPF 5でIntermandibularis前部、転下顎と分度器Hyoideusの平均筋力を計算。 （Lorga ら 、2011）（n = 3）でした。

有限要素解析は、荷重がかかった構造物の機械的性能を調査するためによく使用されるツールです。ここでは、ゼブラフィッシュの顎の生体力学のモデリングにその使用を適用します。

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

このモデリング手法の全般的な目的は、発達中のゼブラフィッシュの顎が受ける機械的環境をシミュレートすることです。この手法は、機械的負荷のパターンが時間とともにどのように変化するか、また、これらの負荷がどのように細胞挙動を刺激するかなど、筋骨格系分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、機械的環境という文脈において、遺伝子発現のパターンや細胞挙動の変化を分析できることです。この方法は、骨格の発達に関する知見を提供し得ます。また、高次脊椎動物の骨格要素や心血管系など、機械的な負荷を受けるあらゆる生物学的構造に適用することが可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、用語やソフトウェアが工学的な背景知識を前提としているため、習得に苦労する可能性があります。骨格要素の形状を可視化し、筋肉量を定量化し、筋肉付着部の正確な位置を特定するには、骨格ミオシンおよびII型コラーゲンを用いて、適切な齢の魚を免疫染色してください。まず、魚の稚魚を4%パラホルムアルデヒドおよびPBSで1時間固定します。次に、PBTで2回洗浄し、固定液を除去します。続いて、50% methanolおよびPBTで5分間、さらに100% methanolで5分間、幼虫を脱水します。その後、幼虫は必要になるまで100% methanol中で保存可能です。必要に応じて、50% methanolおよびPBTで幼虫を5分間再水和させます。その後、PBTで5分間洗浄します。次に、0.25% trypsinおよびPBTを用いて、氷上で5〜6分間幼虫を透過処理します。次に、PBTで5分間洗浄し、PBTによる洗浄をさらに3回繰り返します。抗体を適用する前に、5% serumとPBTを用いて幼虫を2～3時間ブロッキングします。その後、5% serumとPBTに含まれる、推奨希釈倍率で調製したrabbit anti-type II collagenおよびmouse anti-myosin抗体溶液で幼虫をインキュベートします。このインキュベーションを室温で1時間、または4 °Cで一晩行います。一次抗体を適用した後、幼虫をPBTで計6回、1回につき15分間洗浄します。PBT洗浄後、5% serumおよびPBTによるブロッキングを1〜2時間行います。次に、二次抗体を適用します。これ以降、調製物は可能な限り遮光して保持してください。5% serumおよびPBTに含まれる蛍光標識抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体を使用します。二次抗体を適用した後、幼虫をPBTで6回洗浄し、1回あたり10分間洗います。上述の方法で染色された、または蛍光タグを発現している幼虫は、以下の手順で共焦点顕微鏡を用いてイメージングできます。10倍の対物レンズを使用し、約2.5倍のデジタルズームで関心領域の共焦点画像スタックを撮影します。488ナノメートルレーザーと561ナノメートルレーザーを用いて、グリーンチャンネルとレッドチャンネルを励起させます。次に、z平面の間隔を1.3 micronsとし、3回のライン平均を用いて512平方ピクセルの画像を撮影します。スタックを埋めるには約100枚のzセクションが必要です。データをTIFF画像スタックとしてエクスポートします。適切なソフトウェアでTIFF画像スタックを開き、すべてのチャンネルを表示します。軟骨（cartilage）チャンネルを右クリックし、orthosliceを選択して作成します。次に、軟骨チャンネルを右クリックしてImage Processing、Smoothing And Denoisingを選択し、image filterを選択してsmoothing Gaussianをオンにします。プロジェクトビューで、フィルタリングされた画像を右クリックして「image segmentation」を選択し、「edit new label」をクリックします。軟骨や関節など、各組織に対して新しいラベルを作成してください。次に、「all slices」トグルをオンにした状態でマジックワンドツールを使用して画像内の軟骨領域を選択し、ブラシツールを用いて輪郭からノイズを除去します。次に、ブラシツールで関節領域を選択し、それを関節コンポーネントに割り当て、関節全体にわたってこの操作を繰り返します。複数のスライスを一度に平滑化するには、トップメニューから「Segmentation」を選択し、「Smooth labels」を選択します。その後、コンポーネントの3D表面レンダリングを作成するために、画像上で右クリックし、「Generate Surface」を選択します。次に、レンダリングされた表面をクリックし、メッシングソフト用のHMASCIIファイルとしてデータを保存します。3Dメッシュの生成は、良好なモデルを作成する上で極めて重要なステップです。モデル化しようとしている構造の正確な形状を再現しつつ、角度が極端に小さい、あるいは大きいといった問題のある要素を導入しすぎないよう、詳細度のバランスを調整する必要があります。メッシュを作成するには、対応するソフトウェアパッケージに3Dモデルをインポートします。軟骨および関節表面の2次元メッシュを作成するには、2Dメニューにあるシュリンクラップツールを使用します。要素サイズは1.5から2.5の間で選択してください。3Dメッシュの最適化を行うために、さまざまなサイズのサーフェスメッシュを作成できます。関節面と軟骨面の間でメッシュが連続していることを確実にするため、境界上のすべての要素は共通のノードを共有している必要があります。これを実現するには、関節の内表面を削除し、中空のチューブ状にします。F2ファンクションキーを使用して、「要素の削除（Delete Elements）」メニューのショートカットにアクセスします。削除する要素を選択してください。境界ノードを調整し、軟骨表面に合わせます。F2、F3、F6のファンクションキーをそれぞれ使用して、ノードの削除、移動、および新しい要素の作成を行います。最後に、「collector organize components」メニューを使用して、関節部位の軟骨表面を複製します。F2ファンクションキーを使用して、関節以外のすべての要素を削除します。その後、「Check elements」パネルに移動して品質チェックを行います。メッシュ内に重複要素、挿入、および貫通がないか確認してください。もし見つかった場合は、「Tools」タブを使用して編集します。モデルツリーオプションにあるユーティリティタブを使用して、二面角を確認します。異なる要素サイズの2D表面メッシュから3Dメッシュを生成するには、Tetrameshツールを使用してください。異なるメッシュサイズを比較し、さらなるシミュレーション後に収束し、かつ形状の定義を損なわない最小のメッシュサイズのFEモデルを選択します。次に、Distanceツールを使用して、顎のモデルが適切なスケールになるようにメッシュを変形させます。マージされたモデルをエクスポートするか、タイ（ties）を使用して、モデル内で軟骨成分と関節成分が接続されていることを確認してください。続いて、顎の機能をシミュレートするために、有限要素（FE）モデルに荷重、拘束、および材料特性を適用します。ラベル付きの共焦点スタックをガイドとして、筋肉を定義します。まず、筋肉の付着点に対応するノードを割り当てます。次に、各筋肉の起始点と停止点を表すベクトルをノード間に作成します。すべての筋肉を定義した後、履歴荷重コレクター（history loadcollector）を作成し、各筋肉にCloadを適用します。大きさをnewtonsで指定し、関連するベクトルを割り当ててください。次に、文献で決定された適切な等方性弾性材料特性を割り当てます。次に、境界荷重コレクターを作成し、モデルにいくつかの初期拘束を適用します。拘束するノードを選択し、それらのノードによって定義される筋肉の自然な可動範囲に近い自由度係数を選択してください。これで、シミュレートする各動作タイプに対応するロードステップを作成します。解析メニューの下で、指定する動作をシミュレートするために、関連するすべての荷重と拘束を選択します。次に、ドロップダウンメニューから「静的（static）」を選択します。準備ができたら、メッシュ、荷重、拘束、および材料特性を含む適切なファイル形式でモデルをエクスポートします。このケースでは、INP形式を選択します。次に、モデルをFE解析ソフトウェアに読み込みます。そこでモデルのジョブを作成・実行し、応力、ひずみ、変位などの出力を解析します。3〜6匹のトランスジェニックゼブラフィッシュ幼魚を選択し、接触への反応がなくなるまで0.02% MS-222で軽く麻酔します。ただし、心拍が維持されていることを確認してください。次に、Danieau溶液を用いて調製した、ぬるい1%低融点アガロースを用いて、幼魚をカバーガラス上に側方から固定します。続いて、ピンセットを用いて頭部と顎の周囲から慎重にアガロースを除去します。次に、パステールピペットを用いて、新鮮なDanieau液を幼虫の頭部に流し、麻酔剤を除去します。口の正常な動きが再開するまでこの操作を繰り返します。その後、動画キャプチャソフトウェアを使用して、口の動きの蛍光高速ビデオを撮影します。顎の開口サイクルを複数回記録するのに十分な時間、最高フレームレートで撮影します。その後、顎の最大変位を解析します。顎が最も大きく開いたフレームを選択し、メッケル軟骨の前端と上顎との間の距離を測定します。上顎の基準点は、篩板（しばん）の先端に相当します。筋肉と軟骨の免疫染色、またはトランスジェニックリポーターのイメージングにより、顎の3次元構造に関連する筋肉とともに可視化することが可能です。高解像度でイメージングを行うことで、顎の3次元的な形状を捉えたモデルを構築することができました。このモデルには、筋肉と軟骨の共焦点画像から導出された配置および大きさの荷重が組み込まれています。このモデルを用いて、さまざまな範囲の材料特性を検証しました。ハイスピードビデオキャプチャで観察された生体内の変位を利用し、その可動範囲を最も正確に再現するモデルを1つ選定しました。最も正確な材料特性、荷重、およびメッシュ形状のデータを用いて、FEモデルにより、この期間中に生じる機械的環境の最良の推定値を検討しました。例えば、応力の大きさを測定しました。このモデルを拡大してパターンの微細な詳細を確認し、さらにデジタル断面で観察することで、あらゆる次元の詳細を把握することが可能です。このビデオを視聴することで、共焦点イメージングを用いて、機械的負荷がかかっている生物学的構造の生理学的に正確な3Dモデルを構築する方法について、十分な理解を得ることができます。この手順を行う際は、これが線形弾性モデルであり、軟骨が完全に線形材料として振る舞うわけではないことを覚えておくことが重要です。透過性などの他の材料特性を組み込むことも可能ですが、その場合はメッシュにさらなる修正が必要になる場合があります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ここで説明するプロトコルは、生後5日のゼブラフィッシュ幼虫の頭蓋顔面軟骨を染色および解剖するための簡単で従いやすい手順を示しています。さまざまな発達条件下でのこれらの構造の解剖学的構造、形状、サイズを研究するために使用できます。...

アルシアンブルー染色時のゼブラフィッシュ頭蓋顔面組織の解剖

本研究は、ゼブラフィッシュ幼生の顔面構造変化を測定するために、無料ソフトウェア(tpsDigs2、MorphoJ、PAST)を用いて頭蓋顔面軟骨の形状を定量化するプロトコルを説明しています。...

形状の形態計測解析:ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面形状定量化のための解析ソフトウェアツールボックス

学ぶ有限要素解析を用いたゼブラフィッシュ顎のバイオメカニクスシミュレーション手法。コンフォーカル顕微鏡と3Dメッシュ生成で機械的環境を可視化し、骨格発生と細胞挙動の関係を解明する計算モデリング技術です。

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

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