分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

分裂酵母は、 分裂酵母は、細胞質分裂を研究するための優れたモデル系、細胞分裂の最終段階です。ここでは、ライブ分裂酵母細胞内の異なる細胞質分裂のイベントを分析するために、顕微鏡のアプローチを説明します。

この生細胞顕微鏡技術の全体的な目標は、分裂酵母モデル系の細胞質分裂中に発生する時空間的な事象を研究することです。この方法は、細胞質分裂のさまざまな段階の経時的な分子詳細など、細胞動態分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞動態機構のさまざまな空間成分を、細胞への毒性を最小限に抑えながら長期間にわたって分析できることです。

この方法は、細胞質分裂酵母に関する洞察を得ることができますが、出芽酵母やその他の真菌にも適用できます。この手順を開始するには、ビタミンCを混ぜた3〜4ミリリットルの溶融培地をガラス底の培養皿に注ぎます。培地が固まったら、鋭利なメスを使用して培地スラブを培養皿からゆっくりと持ち上げ、培地スラブと培養皿の間にピペットチップを配置して、スラブが皿に戻らないようにします。

次に、培地スラブと培養皿のガラス底部の間に2〜5マイクロリットルの再懸濁細胞培養をロードします。次に、ピペットチップを非常に静かに取り外し、培地スラブを培養皿の元の位置に戻します。培養皿内の細胞を、顕微鏡検査が行われる温度の暗闇で30分から1時間インキュベートします。

細胞をイメージングする準備ができたら、培養皿のガラスの外側に野生を一滴垂らします。培養皿を倒立顕微鏡に置きます。細胞の内側面に焦点を当て、細胞が十分な間隔で、密集しすぎないようにします。

細胞周期の適切な段階で細胞の画像取得を開始するようにしてください。この実験では、G2後期です。次に、画像取得ソフトウェアをプログラムします。DIC の露光時間を 100 ミリ秒に設定します。

GFPおよびRFPフィルターの場合、75ミリ秒の露光時間を使用します。レーザー出力を50%に設定しますが、これは個々の実験によって異なることに注意してください。3次元で画像をキャプチャするには、ソフトウェアをプログラムしてZシリーズを取得します。

最大ステップ サイズを 4 マイクロメートル、セルの中心焦点を中心とする距離を 3.0 マイクロメートルにして、合計 Z 距離 6 マイクロメートルに対して、時点あたり 16 の Z フレームをキャプチャする。これらのパラメータは、セルの厚さに応じて変更できます。2分ごとに画像を撮影するようにプログラムを設定します。

実験の要件に基づいて露光時間を選択します。この例では、75 ミリ秒が使用されています。90分後に取得を停止するようにソフトウェアをプログラムします。

そして、画像取得を開始します。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析します。まず、各波長の画像シリーズを開きます。

調査するセルを選択します。ツールバーの線オプションをダブルクリックして、線幅を調整するための別のウィンドウを開きます。線幅は、野生型セルの約 40 から 50 ピクセルであるセル幅に対応するように調整します。

目的のセルの長軸に沿って線を引きます。[分析]、[ツール]、[ROIマネージャー]の順にクリックし、[追加]をクリックします。これにより、選択したラインがROIウィンドウに追加され、後で使用できるようになります。

このウィンドウは閉じないでください。目的の画像をクリックし、[編集]、[選択]、[傾き補正]の順に選択します。スタック全体のプロセスをチェックして、セルを水平方向にまっすぐにします。

画像をクリックしてから変換し、右に90度回転して画像を垂直にまっすぐにします。画像をクリックしてからスタックし、モンタージュを作成します。これにより、スタックの行数と列数、画像サイズのスケール係数、モンタージュの最初と最後のスライスまたはフレーム、およびモンタージュのフレーム増分を割り当てるためのウィンドウが開きます。

ラベルスライスを確認し、Enterキーを押します。目的のセルのモンタージュが表示されたウィンドウが表示されたら、他の波長の画像シリーズを開きます。ROI マネージャーで、行識別子をクリックして、2 番目の画像ファイル上の同じセルを選択します。

前の手順を繰り返して、2 番目の画像のモンタージュを開きます。スピンドル ポール ボディ マーカー Sad1-mCherry の画像で、スピンドル ポール ボディ マーカーの分離を探し、その時点を時間 0 としてマークします。画像上の環タンパク質Rlc1-トマトのシグナルを経時的に追跡し、Rlc1-トマトのパッチとは対照的に明確な線として現れるシグナルを探します。

この時点は、アクトミオシン環の組み立ての完了または成熟段階の開始を示します。次に、ムービーを経時的にスクロールして、Rlc1-トマトリングのサイズが縮小し始めるタイミングを判断します。これは、成熟期の終わりまたはリング狭窄の開始としてマークされます。

Rlc1-トマトシグナルは、細胞軸の中央に点として現れるまで、狭窄全体を通して経時的に追跡します。これは、リングのくびれの終わりまたは中隔の侵入の終わりとしてマークされます。DIC イメージのモンタージュに従って、アブシッションがいつ完了したかを確認します。

セルが物理的に分離した時点を記録します。この分析は、目に見えるアクトミオシンリングを持つ細胞を選択することから始めます。ImageJツールバーの線オプションをダブルクリックします。

線幅は、リングの太さに約15〜20ピクセル対応するように調整します。リングに沿って線を引き、リングの全体の厚さが含まれるように注意します。[分析]、[ツール]、[ROI マネージャー] の順にクリックし、[追加] をクリックします。

これにより、後で使用するために選択行が ROI ウィンドウに追加されます。このウィンドウは閉じないでください。目的の画像をクリックし、[編集]、[選択]、[傾き補正]の順に選択します。

リングを水平にまっすぐにするために、プロセス全体のスタックを確認します。画像を使用してZスタックの直線化で最も明るい平面の強度をリセットし、調整してから明るさとコントラストをリセットし、リセットします。SGKのタブをクリックし、次に3Dプロジェクトをクリックして、ダイアログボックスを開きます。

投影方法を最も明るい点に変更し、スライス間隔を 2 から 3 ピクセルに変更します。最後に、回転軸を目的の視野角に応じてX軸またはY軸に変更します。「補間」をクリックし、「OK」をクリックして、画像の 3D 投影を生成します。

画像の下にあるスクロールバーを使用して、画像を回転させます。次に、他の波長の画像シリーズを開きます。ROI マネージャーのライン識別子をクリックして、2 番目の画像ファイルで同じリングを選択します。

前の手順を繰り返して、画像内の 3D リングを他の波長で開きます。両方の3D画像リングを開いた状態で、画像をクリックし、次に色をクリックしてから、チャネルをマージします。ドロップダウンメニューから各画像を選択して、対応する色を選択し、[OK]をクリックします。細胞動態リングまたは侵入膜での局在に関して、さまざまなマーカーの局在を比較します。

紡錘極体マーカーSad1-mCherryおよびリングマーカーRlc1-GFPで発現した分裂酵母細胞を、細胞質分裂中にイメージングした。スピンドルポール本体の分離は 17 分で発生し、時間ゼロとして指定されました。Rlc1-GFPは、スピンドルポール本体が分離する4分前に分割部位に現れます。

スピンドルポール本体の分離後、リングの成熟は10分で始まります。リングの狭窄は31分で始まり、53分で終わります。最後に、細胞の離脱は紡錘体極体分離の80分後に起こります。

前の画像で決定された細胞動態イベントのタイムラインは、紡錘極体マーカー間の距離によって決定される有糸分裂を参照してグラフにプロットできます。細胞質分裂中の分裂部位におけるリングマーカーRlc1-tomatoと中隔膜マーカーBgs1-GFPの分析により、リングはBgs1-GFPの動員前に組み立てられたことが明らかになりました。リングが収縮すると、Bgs1-GFPは収縮リングに隣接する侵入膜にも局在します。

最後に、Rlc1-トマトシグナルは環狭窄後に消散しますが、Bgs1-GFPはディスクとして現れ、膜バリア内に残ります。細胞動態イベントの効率は、リングに沿ったタンパク質の分布によって決定できます。ここで、リングに沿ったCdc15-GFP分布は、左の画像では偶数ですが、右の画像では不均一です。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜3時間で完了します。この手順を試行する際には、適切なフィールドを持つ細胞、理想的にはG2後期またはM期初期に6〜8個の間隔の空いた細胞を含み、寒天中に目に見える不純物がない細胞を選択することを忘れないでください。このビデオを見れば、細胞質分裂中のタンパク質局在を時空間的に解析する方法を十分に理解できるはずです。