ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

筋肉細胞は最も複雑な真核細胞の一つです。私たちは、すべての発達段階で遺伝子操作と明確なイメージングを可能にする、高度に成熟した筋線維のin vitro分化のためのプロトコルを提示します。

この手順の全体的な目標は、単離された新生児マウス筋芽細胞を使用して筋線維分化の動的プロセスを研究するために、in vitroで成熟筋線維を生成することです。この方法は、筋線維の分化中に発生する横せん断トライアド形成、サルコメアと筋原線維の集合、およびオルガネラの位置に関する医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点の1つは、抗および筋原線維の分化プロセスをin vitroのタイムラプス顕微鏡で容易に画像化できることです。

出生後6〜8日のマウスの皮膚を70%エタノールで滅菌することから始めます。次に、背側の皮膚を切開し、後肢の筋肉組織が完全に露出するまで、皮膚を後肢に向かって優しく引っ張ります。筋肉を傷つけずに脂肪組織を取り除きます。

次に、背肢の後肢の筋肉を切除するために、手足を伸ばしたまま、かかと腱を露出させます。腱から始めて、はさみを使って骨に沿って優しく上向きに切ります。筋肉を氷のように冷たいPBSに入れて収穫します。

次に、細い先端の鉗子で大腿四頭筋をつまみ、大腿骨や膝関節を傷つけずに筋肉の周りをカットします。大腿四頭筋を他の組織サンプルとプールします。滅菌層流細胞培養フードで、PBSを収集皿から廃棄し、滅菌湾曲ハサミを使用して組織をミンチにします。

すべてのサンプルが処理されたら、組織片を5ミリリットルの消化混合物が入った50ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに移し、摂氏37度で90分間攪拌しながらインキュベートします。インキュベーションの終了時に、6ミリリットルの解剖培地で消化を停止し、残りの組織を遠心分離によりペレット化します。消化後のクリーンセル懸濁液の単離は、プロトコールの成功にとって非常に重要です。

必要に応じて、破片の吸引または追加の遠心分離を行って、サンプルの汚染を防ぐことができます。上清を慎重に収集し、細胞懸濁液を遠心分離します。2番目のペレットを5ミリリットルの新鮮な解剖培地に再懸濁します。

次に、40ミクロンのセルストレーナーでスラリーをろ過し、25ミリリットルの解剖培地をシングルセル懸濁液に加えます。細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートし、線維芽細胞が接着できるようにします。インキュベーションの最後の1時間の開始時に、マウス1匹あたり2つの35ミリメートル皿に500マイクロリットルの1%基底膜マトリックスを冷たくIMDM培地で室温で1時間コーティングします。

プレメッキの最後に、上清を収集し、浮遊セルを遠心分離します。筋芽細胞と増殖培地を再懸濁し、細胞をカウントした後、播種に適した細胞濃度に容量を調整します。次に、基底膜マトリックスコーティングプレートをDPBSで洗浄し、細胞培養インキュベーターでインキュベーションするために細胞を直ちにプレート化します。

3日後、製造元の指示に従って適切なトランスフェクション試薬で細胞を処理し、目的の脂質複合体と細胞を5%二酸化炭素中37°Cで5時間インキュベートします。次に、分化培地で2回の洗浄を行い、細胞をインキュベーターに一晩戻します。翌日、各皿の培地を200マイクロリットルの50%基底膜マトリックスと氷冷分化培地と交換します。

細胞インキュベーターでさらに30分後、培養物にアグリンと新鮮な分化培地を補充し、細胞が完全に成熟するまで毎日細胞の分化と生存率を監視します。免疫染色では、目的の実験時点で、細胞をDPBSで洗浄し、続いて室温で4%パラホルムアルデヒドに固定します。10分後、細胞をDPBSでさらに2回洗浄し、続いて0.5%Triton X 100で室温で5分間透過化します。

さらに2回のDPBS洗浄後、非特異的結合をブロッキング溶液で室温で30分間ブロックします。次に、目的の一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、室温でDPBSで5分間の洗浄を3回行い、培養物を適切な二次抗体と1m1リットルあたり0.2μgのDAPIで1時間インキュベートします。

先ほど示したようにさらに3回のDPBS洗浄を行った後、サンプルを200マイクロリットルの封入培地にマウントし、細胞をイメージングします。増殖2日目には、筋芽細胞はプレートに付着し、典型的な紡錘状形状を示し、広範な増殖が自発的な筋管形成につながるはずです。筋管は急速に伸長し、中央に整列した複数の核を示し、成熟した筋線維の数は時間とともに増加し、細胞の厚さ、縞模様、および末梢核が高くなります。

分化8日目に固定された筋線維は、T細管と筋小胞体の成分をイメージングすることによって確認されたように、横方向のトライアドを示し、トライアドで共局在することが期待されます。分化3日目以降、細胞は自発的なけいれんを示し、カルシウムセンサートランスフェクション後のカルシウムピークと相まって観察できます。さらに、イメージング後、3D再構成を行うことで、筋肉の複雑な構造の組織とダイナミクスをよりよく理解することができます。

この手順を試みるときは、速く、これらの敏感な細胞をインキュベーターの外で長時間保持しないように注意することが重要です。この手順に続いて、電子顕微鏡、超解像顕微鏡、レーザーマイクロダイセクション、レーザーオブレーションなどの他の方法を実行して、これらの新生児筋細胞のさらなるダウンストリーム分析を行うことができます。このビデオを見た後、新生児の筋肉から筋芽球を分離する方法と、タイムラプスイメージングに最適な条件下で高度に分化した筋線維のin vitro生成のためにそれらを培養する方法を十分に理解しているはずです。