網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

この手順の全体的な目標は、蛍光標識された単一細胞を生きたホールマウント網膜から単離することです。この方法は、神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、特定のニューロンクラスにはいくつのサブタイプが存在するのか、各サブタイプの遺伝子マーカーは何か、などです。

この技術の主な利点は、網膜組織の解離の必要性をなくし、細胞が分離前により健康な環境で生存できるようにすることです。この手法の意味は、蛍光標識された任意の細胞集団にまで及ぶため、他のシステムに適用して、健康と疾患における細胞の多様性と機能を理解することができます。一般に、この手法は、細胞の生存率を損なうことなく細胞をパッチクランプする研究者の能力に依存しているため、この方法に不慣れな個人は苦労するでしょう。

この方法の将来のデモンストレーションは、RNAの単離ステップを学ぶのが難しい可能性があるため、適切かつ迅速に処理しないと少量のRNAが簡単に分解される可能性があるため、非常に重要です。この手順を開始するには、角膜を針で突き、角膜と強膜の境界で切り取ります。次に、鉗子を使用してレンズを取り外します。

強膜にそっと裂け目を作り、網膜と強膜が出会う視神経を切断します。網膜から強膜を慎重に取り除きます。次に、透明なガラスを取り出します。

網膜を半分にスライスし、酸素化された細胞外溶液に室温で使用まで保存します。組織を記録チャンバーにマウントする準備ができたら、網膜の一部を酵素溶液に移し、500マイクロリットルの酸素化細胞外溶液で希釈したシャーレでシェーカーで2分間インキュベートします。続いて、酸素化された細胞外溶液で網膜を洗浄し、プラスチック製の転写ピペットでガラス底の記録チャンバーに移します。

その後、鉗子を使用して、視細胞層を下に向けて組織を慎重に平らにします。ピペットで余分な水分を取り除き、ナイロンメッシュのプラチナリングで組織を固定します。次に、酸素化された細胞外溶液をチャンバーに充填し、顕微鏡ステージにマウントします。

酸素化された細胞外溶液で組織を毎分2〜4ミリリットルで灌流します。この手順の準備として、マイクロピペットプーラーを使用して電気生理学的記録のためにいくつかのガラスマイクロピペットをパルスします。IR-DIC光学系を用いて神経節細胞層を観察します。

次に、約480ナノメートルの落射蛍光を使用してGFPと神経節細胞を同定します。次に、DIC内の細胞内溶液を充填したピペットの位置を確認します。わずかな正圧を加え、アンプの電圧オフセットをゼロにします。

その後、GFP陽性セル上のガラスマイクロピペットを下げ、テスト電圧コマンドステップを適用してシール抵抗を監視します。負圧は、ピペットと細胞膜との間にギガオームシールを形成する必要があります。安定したシールを形成した後、負圧の短いパルスを適用してメンブレンを破裂させ、細胞全体にアクセスできるようにします。

細胞の樹状突起が蛍光トレーサーで満たされるまで1〜2分待ちます。このステップでは、10ミリリットルのシリンジで負圧を加えることにより、細胞の細胞質含有量をピペットに慎重に抽出します。その間、DICで抽出を監視し、サイズが小さくなる細胞体を視覚化します。

細胞質内容物を抽出した後、ピペットを組織から慎重に持ち上げ、ピペットを溶液からすばやく取り出します。次に、ピペットをヘッドステージホルダーからすばやく取り外し、ピペットチップをDEPC処理されたH2Oで短時間すすぎます。次に、ピペットをぴったりとフィットするチューブを介して1ミリリットルのシリンジに接続します。

直ちに細胞を10マイクロリットルの溶解バッファーに排出し、1つは0.2ミリリットルのPCRチューブに注入します。卓上型ミニ遠心分離機でチューブを2000倍gで10秒間短時間遠心分離します。その後、すぐにサンプルをドライアイスで5分間急速凍結します。

冷凍後、最良の結果を得るために、摂氏マイナス80度で最大2週間保管してください。この手順に備えるには、逆さにしたP20またはP200チップホルダーの上部を96ウェル磁気スタンドにテープで固定して、磁気セパレーター装置をセットアップします。次に、サンプルあたり約1ミリリットルの新鮮な70%エタノールを調製します。

RNA磁気ビーズを4°Cで保存し、室温で解凍します。RNAビーズが室温になったら、溶液が十分に混合されるように、30秒間ボルテックスします。その後、細胞を室温で1分間解凍します。

次に、各サンプルに5マイクロリットルのRnaseフリーH2Oを加え、ピペットで上下します。その後、各チューブに22マイクロリットルのRNAビーズを加え、十分に混合します。サンプルを室温で5分間インキュベートして、RNAが磁気ビーズと相互作用して結合できるようにします。

その後、チューブを磁気セパレーター装置に8分間置きます。先に進む前に、上清が透明であることを確認してください。1つのパレットからビーズを観察し、ピペッティング中にチューブの側面からビーズを剥がさないように注意してください。

サンプルから上清を取り除き、150マイクロリットルの70%エタノールを加えます。次に、エタノールを取り除き、洗浄をさらに2回繰り返します。サンプルを6分間風乾させます。

チューブの底にさらにエタノールが集まっているかどうかを断続的に確認し、それに応じて取り出します。ビーズを適切に乾燥させることが重要であることを忘れないでください。ビーズが十分に乾燥していないと、エタノールが溶離液に運ばれて総収量が減少する可能性がありますが、ビーズが乾燥しすぎるとRNAが失われる可能性があります。

サンプルを乾燥させている間に、19マイクロリットルの溶解バッファー2と1マイクロリットルのRnase阻害剤を組み合わせて、10x反応バッファーを調製します。それを少しスピンダウンして氷の上に置きます。サンプルが乾燥し、ビーズペレットが光沢がなくなったら、マグネティックセパレーターからチューブを取り外し、9.5マイクロリットルのRnaseフリーH2Oを追加してサンプルを再水和します。

次に、サンプルを氷上に置き、各サンプルに1マイクロリットルの10x反応バッファーを加えます。この画像は、網膜の神経節細胞層を、IR-DICを使用して全マウント網膜調製物で視覚化したものです。同じ調製物を約480ナノメートルの落射蛍光法で可視化し、GFP陽性神経節細胞を同定しました。

この画像は、パッチクランプ記録の標的とされ、蛍光トレーサーで満たされたGFP陽性細胞を示しています。内側の網状層のオンおよびオフサブラミナで画像化されたipRGC樹状突起の共焦点画像は、これらの細胞タイプの分類を可能にします このバイオアナライザーの出力は、逆転写、増幅、および精製を受けたライブラリの例を示しています。レーン 1 から 3 は理想的な DNA スメアを示し、レーン 4 は処理が不十分なサンプルを示しています。

コントロールレーンには、35 bp と 10380 bp のマーカーサイズで 2 つのクリーンなピークが含まれている必要があります。これは、約 2 kb の高強度で正常に調製された 1 つのライブラリの詳細なトレースです。このトレースも、調製が成功したことを示していますが、塗抹標本は500 bp付近を中心としています。

この画像は、サンプルのタグ付け、増幅、精製後のバイオアナライザーの出力を示しています。ここでは、正常にタグ付けされたサンプルの詳細なトレースを、レーン 1 のサンプルに対応しています。不完全なタグ付けは、ここで見られるようなトレースをもたらし、新たに希釈して再タグ付けする必要があります。

このビデオを見れば、無傷の網膜で蛍光標識された細胞タイプからRNAを単離する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、RNAが分解に非常に敏感であり、健康な網膜細胞を持つことが重要であることを覚えておくことが重要です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。

この手順に続いて、qPCR、NC2ハイブリダイゼーション、免疫組織化学などの他の方法を実行して、同定された遺伝子が特定の細胞サブタイプに特異的であるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、神経科学の分野の研究者が、さまざまな脳領域のニューロンの不均一性を理解しようとする道を開きました。この不均一性を理解することで、分子的に同定された集団における細胞機能と接続性に関する将来の研究が可能になります。