ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

こんにちは、ニューメキシコ州立大学の分子ベクター生理学研究室のイモ・ハンセンと申します。本日ご紹介する蚊の脂肪体培養システムは、私たちの研究室で使用している、蚊の腹壁に付着した生きた脂肪体組織の生理と代謝を研究するための体外臓器培養システムです。昆虫の脂肪体は、多くの代謝過程が起こる器官です。

その機能は、脊椎動物の肝臓や脂肪組織の機能を反映しています。このシステムを用いて、黄熱病に感染する蚊Aedis aegyptiの卵黄タンパク質産生制御と栄養取り込み機構を研究しました。Aedi aegyptiは、デング熱、チクングニア熱、ジカ熱などのアルボウイルスの主要なベクターです。

蚊の脂肪体は、蚊の卵黄タンパク質の唯一の供給源です。このビデオプロトコルは、体外蚊の脂肪体培養システムを示し、システムのいくつかの実験的応用を示しています。今回紹介するプロトコルは、複数の部分に分かれています。

まず、脂肪体培養システムに必要な溶液と試薬を準備します。次に、脂肪体を分離するために蚊の解剖を行います。そして最後に、単離した脂肪体をアミノ酸が豊富な培地に移し、卵黄タンパク質の合成を活性化します。

脂肪体培養後に実行できるいくつかのダウンストリームアプリケーションがあります。今日は、ファットボディカルチャーとそれに続く次世代シーケンシングを行います。非刺激サンプルとアミノ酸とエクジソンで刺激された1つのサンプルの2つのサンプルを比較します。

必要となる追加の材料と機器には、蚊収集用の収集バイアルを備えた吸引器、CO2ガスボトルに接続されたCO2フライパッド、フライパッドを洗浄するためのエタノール、光源付き実体顕微鏡、解剖マイクロハサミ、先端の細いピンセット、96ウェルプレートが含まれます。脂肪体培養の準備をするためには、アミノ原液、ネッタイシマカ生理食塩水原液、カルシウム原液の3つの原液と試薬を調製する必要があります。ネッタイシマカ生理食塩水原液とカルシウム原液を組み合わせて、脂肪体培養培地を作ります。

この実験に使用する蚊は、羽化後少なくとも3日経過している必要があります。電池式の吸引器を使用して、蚊を収集バイアルに集めます。サンプルと一緒に収集バイアルをCO2パッドに置き、蚊に麻酔をかけます。

あるいは、氷を使用して蚊に麻酔をかけることもできます。解剖を開始する前に、すべての男性を捨ててください。まず、視認性を確保するために、テスト用の蚊を使用して解剖顕微鏡の焦点を合わせます。

顕微鏡の焦点を合わせたら、顕微鏡に凹型スライドを置き、中央にAPSを2滴垂らします。APSは、蚊を高く保ち、さまざまな蚊の器官を収集するのに役立ちます。鉗子で蚊を選択し、蚊を足で拾います。

脚を取り外します。左手で蚊の胸部を押さえながら、他の鉗子を使って腹部の最後の2つまたは3つの部分で蚊をつかみ、そっと引っ張って取り除きます。この作用により、卵巣、マルピーギ尿細管、後腸、中腸、および作物が除去されます。

臓器を摘出したら、スプリングハサミを使って脂肪体の解剖を仕上げます。腹部の最後の2〜3つのセグメントを取り除いてできた穴に1つのブレードを挿入し、胸部の下のセグメントに達するまで腹部を縦に切ります。切開後、腹部は外側に拡張する必要があります。

別の切開は、最初の切開が終了した腹部の上部を横切って行われます。切開後、腹部が開いて浮き、キューティクル側を上にして、脂肪体がAPS内に収まります。脂肪体がAPS溶液で少なくとも30分間平衡化したら、脂肪体培養培地に移すことができます。

卵黄タンパク質の遺伝子発現を開始するために、脂肪体を高レベルの遊離アミノ酸と昆虫ステロイドホルモンである20-ヒドロキシエクジソンを含む培地に移します。移された脂肪体は、培地中で6時間インキュベートされます。インキュベーション期間の後、脂肪体は、目的の分析に適したバッファーを備えたエッペンドルフチューブに移されます。

実験の目的に応じて、脂肪体は、qPCR、ウェスタンブロット、プロテオミクス、メタボロミクス、RNA-seqなどのいくつかの後続のプロトコルで使用できます。一例として、ファットボディカルチャー実験を行い、分離した脂肪体を全20種類の天然アミノ酸と昆虫ステロイドホルモンである20-ヒドロキシエクジソンをバランスよく混合した溶液に6時間インキュベートし、対照脂肪体をPS上で同時間インキュベートしたところを6時間インキュベートしました。この図は、私たちの実験のRNA-seq解析の結果を示しています。

ヒートマップは、2つの異なる処理下で培養脂肪体に発現する1256個の遺伝子の遺伝子発現レベルを示しています。これらの遺伝子はすべて、2つの処理間で発現レベルを大きく変化させました。この表は、アミノ酸と20-ヒドロキシエクジソンで培養脂肪体を活性化した後、最も制御が上がった10個の遺伝子を示しています。

予想通り、これらの遺伝子のほとんどは卵黄タンパク質の遺伝子です。蚊の脂肪の体文化に興味を持っていただきありがとうございます。