ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

この手順の全体的な目標は、Gタンパク質共役受容体またはGPCRを含む細胞膜を単離し、機能的なGTP結合エッセイを使用してGPCR薬理学を研究することです。この方法は、確立されたまたは孤立したGタンパク質共役受容体の薬理学的特性に関する生化学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。主な利点は、シンプルで迅速であり、Gタンパク質共役受容体シグナル伝達の最も近位なイベントを測定することです。

まず、ヒト胚性腎臓細胞を10 cmの組織培養プレートに10 cmの完全DMEMでプレート化します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で、70%から80%のコンフルエント度に達するまでインキュベートします。インキュベーション後、メーカーのガイドラインに従って、適切なトランスフェクション試薬を使用してHAMOR1で細胞をトランスフェクションします。

次いで、前述したように細胞を36〜48時間インキュベートする。トランスフェクションした細胞をインキュベーターから取り出した後、培地を吸引し、5ミリリットルの氷冷PBSで細胞をすすぎます。次に、プレートからPBSと余分な液体を吸引します。

次に、600マイクロリットルのバッファー1を細胞に加えます。セルスクレーパーを使用して、プレート表面から細胞を取り外し、細胞懸濁液を1.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで移します。マイクロ遠心分離管を液体窒素ですぐにスナップフリーズします。

サンプルが凍結したら、ライセートを氷上で解凍します。ライセートが解凍されたら、シングルパルスマイクロチューブホモジナイザーを使用して細胞を分離します。そのホモジナイザーを10秒間3〜5回パルスします。

パルスの間にチューブを氷の上に30秒間置きます。これに続いて、サンプルを1, 000倍のgと摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清を氷上の新しい1.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

100マイクロリットルの緩衝液1に口蓋を再懸濁します。サンプルを再均質化し、ホモジナイザーを5秒間3〜5回パルスし、パルス間にチューブを氷上に30秒間置きます。サンプルを2回目に遠心分離した後、上清を混合し、11, 000倍のgと摂氏4度で20分間遠心分離します。

上清を新しい1.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。200マイクロリットルのバッファー2に再懸濁します。次に、口蓋を3〜5回粉砕して均質化します。

サンプルを遠心分離し、上清を吸引した後、粗膜分裂を含む口蓋を50マイクロリットルの緩衝液2に再懸濁します。ストックのS35GTPガンマSを50ナノモル、10ミリモルのトレースHCl、および10ミリモルのDTTに希釈します。結合実験用に250マイクロリットル時のクォートを作成し、必要に応じて急速冷凍して保存します。

次に、1ミリモルDTT、0.1%BSA、10マイクロモルGTPおよび0.1ナノモルS35GTPガンマSの最終濃度を含むように不完全な結合緩衝液を添加することにより、完全な結合緩衝液またはCBBを調製する。MOR1を介したGTP結合に対するペプチドDAMGOの効果をエッセイするには、一連のDAMGO希釈液とCBBを最終容量100マイクロリットルまで調製します。バジルGTP結合を評価するには、100マイクロリットルのCBBを含む1.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブを準備します。

非特異的結合を評価するには、99マイクロリットルのCBBと1マイクロリットルの2ミリモル非放射状標識GTPガンマS.を補充した1.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブを準備します。サンプルを25°Cで30分間、サーモミキサーで300rpmでインキュベートします。グラスファイバーフィルターを蒸留水に10分間予漬します。

サーモミキサーからサンプルを取り出した後、5秒間パルス回転させて、チューブの底に各サンプルを収集します。次に、真空ろ過装置の蓋を外し、予め浸したフィルターを装置の真空ポートに置きます。装置の蓋を再度固定して真空シールを形成し、真空をオンにします。

各サンプルの195マイクロリットルをフィルターにピペットで移します。フィルターを1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーで3回洗浄します。5ミリリットルのシンチレーションカウンティングバイアルをカウンティングラックに入れます。

各バイアルに5ミリリットルのシンチレーション液を加えます。次に、真空をオフにし、真空ろ過装置の蓋を取り外します。ピンセットを使用して、ろ過装置の真空ポートからフィルターをピックアップし、各フィルターをシンチレーションバイアルに落とします。

各バイアルをしっかりとキャッピングした後、サンプルをオービタルシェーカーで摂氏25度で10分間インキュベートします。これに続いて、シンチレーションカウンターをオンにし、標準の関連シンチレーションプログラムを使用してサンプルごとに5分間硫黄35同位体放出を測定するようにカウンターをプログラムし、開始を押して考慮します。自己分画は、核蛋白質ヒストンh2bおよび細胞質蛋白質のグリセロールから膜蛋白質をきれいに分離し、3つのリン酸デヒドロゲナーゼを隠します。

タンパク質は、それぞれの細胞内画分に富んでいます。Ponceau染色の代表は、各画分に等しいタンパク質負荷を示しています。複数の薬理学的パラメーターを駆動して、EC50やヒル係数などのGTP結合実験を介してGPCRリガンド相互作用を特徴付けることができます。

ここでは、DAMGO治療後にMOR1に結合する応答性GTPを示します。このプロットは、MOR1 Gタンパク質シグナル伝達に対するナロキソンのアンタゴニストにおけるDAMGOのアゴニスト活性を示しています。この手法を習得すると、実験条件の数にもよりますが、2〜4時間で完了します。

この手順を試行する際は、予想されるEC50の少なくとも5桁高い位置と低いGPCRリガンド濃度を使用することを覚えておくことが重要です。この手順に従い、目的のリガンドと構造的に類似した分子を評価することで、受容体のリガンドプロファイルを定義するリガンドの重要な構造部分を定義するのに役立ちます。開発後、この技術は創薬に役立ち、研究者がバイアスアゴニズムなどのGPCRシグナル伝達の詳細な側面を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、無線標識GTPを使用して細胞膜を分離し、GPCRの薬理学的特性を測定する方法について十分に理解できるはずです。放射線を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。適切な個人用保護具を着用し、放射線を適切に実験室で着用して作業するなど、予防策を講じる必要があります。

この手順を実行する前に、放射能を扱うための施設のガイドラインを確認する必要があります。