Name: ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ急性アルコール性肝障害の組織学的解析法。Danio rerio幼生を用いて肝脂肪変性と血管腫脹を評価し、人間のアルコール性肝疾患の病態理解に貢献する実験手法を習得する。

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著者はZebrafish International Resource CenterのKaty Murray博士に感謝したいと思います。 CCHMCのStacey Huppert博士とKari Huppert博士は、プロトコルに関する有益な助言を得た。魚のケアのためのCCHMC獣医サービス。この研究はNIH助成金R00AA020514とCCHMCの小児ゲノミクスセンター（CY）の研究助成金によって支えられました。また、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのNIH助成金P30 DK078392（統合形態学コア）も一部支持した。

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<li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li>
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<li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるその後の組織病理学的分析の詳細な手順を記載している。急性エタノール処理は、ゼブラフィッシュ肝臓がアルコール代謝酵素を発現し始める段階であるため、受精後96時間以内に行わなければならない。 2％エタノールは、幼虫が13,14を許容できる最大用量である。エタノール処理された幼虫は、8時間の処理によって肝脂肪症を示し始め、脂肪症を発症する幼虫の割合は、24時間の連続治療14まで上昇し続ける14 。ゼブラフィッシュの幼虫は、120 hpfまで卵黄のみから栄養素を吸収します。したがって、120 hpfを超えるエタノール処理は推奨されていません。なぜなら、断食は脂肪症14にも寄与することができるからです。他のラボで公開されたプロトコルと比較現在の議定書で主に行われた変更は、エタノール処理が14時間の光/ 10時間の暗サイクルを有する魚施設で行われることである。これは、イン...

アルコール過多によって引き起こされるアルコール性肝疾患（Alcoholic Liver Disease：ALD）は、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因である。米国では、肝疾患の死亡のほぼ半分がアルコール1を含み、ALDは3回の肝臓移植2のほぼ1つを担っている2 。 ALDには広いスペクトルがあります。肝細胞における過剰脂質蓄積を特徴とする脂肪症は、飲酒の初期段階で起こり、アルコール使用の停止時に可逆的である。遺伝的および環境的要因および継続的アルコール摂取の影響下で、肝臓脂肪症はアルコール性肝炎および結局は肝硬変に進行することがある3 。げっ歯類のALDモデルを用いた研究では、この疾患に対する十分な洞察が得られているが、限界がある（文献3 ）。アルコール飼料の経口給餌は、げっ歯類4 、5 。炎症および線維化の発症には、侵襲的かつ技術的に挑戦的な第2の傷害6,7または慢性胃内注入が必要である8,9 。また、腸骨ジストロフィーは、慢性および急性のアルコール処置10,11,12,13,14,15の両方に応答して肝損傷を発症する。特に、幼虫ゼブラフィッシュは、急性アルコール性肝臓損傷10,11,13,15を研究するための魅力的な補完的モデル生物である。ゼブラフィッシュの肝臓は機能的であり、エタノール代謝の主要な酵素を4日で産生するゼブラフィッシュ幼虫13,15 で肝臓脂肪症および線維形成反応を誘発するには、エタノールを2％エタノールに24時間暴露すれば十分です。 2％エタノールで24時間処理すると、ゼブラフィッシュの幼虫13の組織エタノール濃度が80mMになることが報告されている13 。他の者は、幼虫がこの濃度を許容し、処置動物に見られる肝表現型がエタノール暴露に特異的であることを示した11,13,15,18。しかしながら、ヒトでは80mMがほぼ致命的であるため、エタノール処理されたゼブラフィッシュの肝組織像を評価し、人間との生理学的関連性を明らかにする。 ゼブラフィッシュの幼虫の急速な外部発生および半透明は、肝臓内のアルコールの作用をリアルタイムおよび固定サンプルで特徴付けることを可能にする。細胞型特異的蛍光トランスジェニック系統の利用可能性と共焦点顕微鏡法の最近の進歩により、異なる肝細胞型が急性エタノール処理11,15に応答して形態および挙動をどのように変化させるかの研究が容易になる。しかし、蛍光トランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点イメージングは​​、肝臓組織学を研究する場合、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を完全に代用することはできない。トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて全ての肝臓細胞型を同時にマーキングするには、個々のトランスジェニック系統を作製する必要があり、それぞれが固有のフルオロフォアを有する肝臓細胞型を標識する。異なるトランスジェニック背景を同じ魚に導入するには、ブリーディングが必要ですg世代を必要とし、時間とコストがかかる。細胞外マトリックス成分を検出するためには、さらなる免疫蛍光染色が必要である。一方、H＆E染色は、同時に全ての肝臓細胞型および細胞外マトリックス成分を標識し、肝臓の概要を提供する。さらに、肝細胞死、脂肪症および線維症などの肝疾患のいくつかの組織病理学的特徴を容易に明らかにする。 H＆Eは哺乳動物の肝臓組織学におけるルーチンの染色であるが、ゼブラフィッシュの肝臓研究では一般的に使用されておらず、プロトコールはあまり確立されていない。 この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるフォローアップ組織学的分析のためのプロトコールを記載する。 H＆E染色プロトコールは、肝臓の発達および機能に関するすべての研究に使用することができる。さらに、パラフィン切片は、免疫組織化学ならびに他の特別なスタチンのために使用することができるTrichrome stain、reticulin stain などの肝臓の病理学的特徴

<table><tbody><tr><td>1.5 mL遠心チューブ</td><td>E &K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td></td></tr>可燃性<tr><td>酢酸</td><td>新参者供給</td><td>10010A</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>研究製品国際</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウムジャーラックホルダー</td><td>新参者供給</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>蓋付き細菌学ペトリ皿</td>コー<td>ニング</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>生検パッド</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>帯電スライド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>透明封入剤</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>8310-16</td><td>他の透明封入剤と交換可能</td></tr><tr><td>商業用海塩</td><td>インスタントオーシャン</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てミクロトームブレード</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ・バイオシステムズ</td><td>ライカ Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>密閉型ティッシュプロセッサー</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>エオシン-フロキシン染色セット</td><td>ニューカマーサプライ</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液、ACS 試薬、37 WT. % H20 中、安定剤として 10 - 15% のメタノールを含有(重合防止用)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>252549 発がん性が疑われる物質; 刺激性</td></tr><tr><td>ホルマリン, 緩衝剤, 10%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SF100-4</td><td>発がん性が疑われる物質; 刺激性</td></tr><tr><td>目盛り付き メディアボトル</td><td>VWR インターナショナル</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>ハリス ヘマトキシリン</td><td>ポリサイエンティフィック R&Dコーポレーション</td><td>s212</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>組織学金型Sakura</td><td>Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr>ホット<tr><td>プレート/スターラーVWR</td><td>インターナショナル</td><td>47751-148</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸(HCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A144</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>インキュベーターVWR</td><td>インターナショナル</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BDメディカル</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>倒立型複合顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>新参者 供給</td><td>12094E</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M9140</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステム</td><td>ライカユングバイオカット 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ニューティングミキサー</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>発がん性が疑われる物質; 刺激性</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>ピペットポンプ (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>グレインジャー</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>スライド染色キット</td><td>ニューカマーサプライ</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>フィッシャーBioReagents</td><td>S318-500</td><td>非常に危険な</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性 (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼ストレーナー (直径 5 インチ)</td><td>適応科学ツール</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>組織カセット</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>組織包埋センター</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュワイパー、1プライ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン粉末/エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A5040</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>トリス塩基、一次標準およびバッファー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>ウォッシュボトル、低密度ポリエチレン、広口</td><td>ナルジュヌンクインターナショナル</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>X3S-4</td><td>刺激剤</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

アルコール性肝疾患（ALD）は、急性または慢性のアルコール乱用による肝臓の損傷を指す。これは、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因の1つであり、米国では200万人を超える人々に影響を与える。アルコール誘発肝障害の根底にある細胞および分子メカニズムのより良い理解は、ALDの有効な治療法を開発するために重要である。ゼブラフィッシュの幼虫は、2％エタノールへのわずか24時間の曝露後に肝脂肪症および線維形成を示し、急性アルコール性肝障害の研究に有用である。この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理の手順を記述し、それが肝臓血管の脂肪症および腫脹を引き起こすことを示している。ゼブラフィッシュの幼虫肝臓の組織学的分析のために最適化されたヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色の詳細なプロトコールも記載されている。 H＆E染色は、免疫蛍光よりもいくつかのユニークな利点があります。細胞外成分を同時に検出することができ、脂肪症および線維症などの肝障害を容易に検出することができる。毒素およびウイルス誘発肝臓損傷ならびに遺伝性肝疾患のモデリングにおけるゼブラフィッシュの使用が増加していることを考えると、このプロトコールは、これらの研究すべてにおいて実施された組織学的分析の参考となる。

10％緩衝ホルマリンおよび4％パラホルムアルデヒド（PFA）は、組織学的プラクティスに使用される最も一般的な固定剤の2つである。しかし、ゼブラフィッシュの肝臓組織の最適な固定結果は得られません（ 図1および表1 ）。 10％ホルマリンまたは4％PFAによる固定は、しばしば収縮をもたらし、肝臓と周囲組織との間に大きなギャップを生じさせる（ 図1A 、 B ; 図1Bは組織収縮の例を提供する）。肝組織の一部もまた切片から脱落することがある。肝細胞の細胞質はしばしば失われる（ 図1A 、 1B ）。両方の固定剤は、それらが収縮または膨潤し、もはや上皮細胞に特徴的な円柱形態を維持しないので、肝細胞の変形を引き起こし得る。 PFAの固定に関する...

このプロトコールは、2％エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

この実験の全体的な目的は、急性エタノール負荷によって引き起こされるゼブラフィッシュ幼魚肝臓の病理組織学的な評価を行うことです。この手法は、急性アルコール性肝障害の組織学的特徴や、急性アルコール障害に対するゼブラフィッシュ肝臓の反応がどの程度ヒトで見られる反応と類似しているかなど、アルコール性肝疾患分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、我々のエタノール処理が、既報の他の手法よりもより強固な反応を誘導することにあります。また、当社の組織学プロトコルにより、切片上の組織の完全性が向上します。まず、パスツールピペットを使用して、浮き袋が膨張している受精後96時間の稚魚を最大40匹選択します。それらを2枚の新しいペトリ皿に均等に分けて入れます。残留している卵水を可能な限り取り除いた後、1mlあたり1匹の密度で、2%エタノールを含む卵水を1つのディッシュに加えます。対照群として、エタノールを含まない同量の卵物をもう一方のディッシュに加えます。対照群とエタノール処理した幼魚を魚類飼育室で24時間保持します。24時間が経過した後、1本あたり20匹までとして、幼魚を1.5 mL遠心チューブに回収します。ドラフトチャンバー内で、幼魚から可能な限り液体を除去し、その後、Dietrich固定液を1 mL以上加えます。室温のニューテーターで、少なくとも24時間固定させます。組織カセットと、カセット1個につき2枚の青色生検パッドを用意します。各カセットの底に生検パッドを1枚ずつ配置します。各カセットに、サンプルを明確に特定できるよう鉛筆でラベルを記入します。ドラフトチャンバー内で、チューブから固定液を取り除き、1 mLのPBSを用いて、幼虫を5分間×3回洗浄します。洗浄中は、チューブを室温のニューテーターに設置してください。洗浄を行っている間に、電子レンジを用いて3%アガロースを水中で加熱し、固形分を融解させます。一度に30秒ずつ加熱し、沸騰を最小限に抑えるよう注意深く観察します。溶解後、液体アガロースを90°Cに設定したホットプレートに置き、穏やかに攪拌します。転送ピペットを使用して、最大8匹の幼虫をプラスチック製組織学用モールドに移し、PBSを可能な限り除去します。先端を切った転送ピペットを使用して、型に3% agaroseを完全に満たします。次に、インスリン用注射器を用いて幼魚を型の中心に集め、底の方へ押し込みます。矢状断を作成する場合は、頭が型の上の方向を向くように幼魚を一列に並べます。肝臓の向きを一定にするため、幼魚の体の左側が下になり、型の底に平らに接するように向きを調整してください。アガロースを4〜5分間静置して固めた後、型からアガロースブロックを取り出し、カミソリで幼魚の周囲のアガロースを切り揃えます。ブロックを垂直に立て、厚みを半分に切り、最終的なブロックの厚さが概ね2〜3 mmになるようにします。この小さなアガロースブロックを準備した組織カセットに移し、ブロックの上に2枚目の生検パッドを載せます。カセットを閉じ、完全に組み立てたカセットを、二回蒸留水で調製した新鮮な70% ethanolが入った密封容器に入れます。組織のパラフィン包埋後、ミクロトームを用いて、組織がパラフィンブロックの表面に現れるまで、一度に5 µmずつ切削して組織を覆っている余分なパラフィンを除去し、切除した切片はすべて廃棄します。ブロックの表面を下にしてPBSに浸し、4 °Cで一晩置きます。翌日、PBSからブロックを1つずつ取り出し、ミクロトームを用いて5 µmの厚さで切片を作成します。ピンセットまたは筆を用いて、最後の切片をブレードからそっと引き離し、切片のリボンをブレードから分離させます。ピンセットでリボンの末端部分をつまんで持ち上げ、42 °Cの水槽に移します。リボン状の組織を少なくとも5分間、水面に浮かせておきます。ピンセットを使用して、スライドに収まるように切片を小さなグループにほぐします。帯電させたスライドを45度の角度で水に入れ、回収する切片のグループの下に慎重に配置します。スライドを水から慎重に引き上げ、切片をスライドに付着させます。糸くずの出ないティッシュを使用して、切片の余分な水分を吸い取ります。スライドをスライドホルダーまたはボックスに入れます。目的の組織が回収されるまで、ブロックの薄切を続けます。完了後、55 °Cのインキュベーターまたはオーブンでスライドを3〜16時間加熱し、パラフィンを融解させます。規定の時間が経過したら、パラフィンが融解したことを確認し、染色前にスライドを冷却させます。スライドを100%キシレンに15分間ずつ2回浸し、脱パラフィン処理を行います。その後、エタノール系列を用いてスライドを親水化させます。各溶液につき、液がスライドからきれいに流れ落ちるまで、1回2秒間の浸漬を8〜10回繰り返します。スライドを100%ろ過済みHarrisヘマトキシリンに4分間浸します。4分後、速やかに脱イオン水の容器に戻します。切片から最も遠い容器の奥の角に脱イオン水を流し込みます。水が紫色でなくなるまで、定期的に容器の中身を捨ててください。グースネックライトを備えた解剖顕微鏡を用いて、ヘマトキシリンの染まり具合を迅速に確認します。さらに染色が必要な場合は、スライドを100%ヘマトキシリン液に戻し、1分間浸します。目的のヘマトキシリン染色が得られたら、スライドを0.05%塩酸に2回浸し、直ちに清浄な脱イオン水の容器に戻します。容器を空にし、水を2回満たして洗浄します。スライドを95% ethanolが入った2つの容器に順に移動させ、それぞれ30秒間浸します。その後、スライドをEosin Y-Phloxine B溶液に2分間浸します。2分後、スライドを元の95% ethanol容器に戻し、解剖顕微鏡下で色の強度を確認します。染色の程度が不十分な場合は、再度Eosin溶液に30秒間浸します。必要に応じてこの操作を繰り返してください。目的の染まり具合が得られたら、スライドを100%isopropanolに15秒間移します。新しい100%isopropanolに交換し、再びスライドをisopropanolに15秒間浸します。この工程を繰り返し、計6回のisopropanol洗浄を行います。100%キシレンに3分間浸した後、スライドを1枚取り出す。切片を十分に覆う量の封入剤を加え、その後、スライドを100%キシレンに浸す。スライドにカバーガラスを載せ、余分な封入剤をペーパータオルで吸い取り、薄い線が見える状態にする。次に、組織（またはティッシュ）をキシレンに浸し、スライドの裏面を拭いて滴り落ちた封入剤を除去する。スライドを段ボールなどの丈夫で移動可能な平面の上に置き、ドラフト内で10分間キシレンを揮発させます。イメージングの前に封入剤を硬化させるため、スライドを室温で一晩放置してください。この受精後120時間のゼブラフィッシュ幼魚の肝臓は、室温で24時間、Dietrich固定液に浸漬しました。この組織の固定には、Dietrich固定液が最適です。10% formalinで固定した場合、肝細胞の細胞質が消失することが頻繁にあります。また、組織がエオシンで適切に染色されず、紫色に現れます。4% PFAで固定した後、肝細胞間に隙間が見られます。4% PFAは肝組織を収縮させるため、肝臓と周囲の組織との間に大きな隙間があるように見えます。点線は周囲組織の境界を示しています。この高倍率像は、エタノール処理研究の一部である野生型の未処理コントロール幼魚における肝臓のH&E染色の結果を示しています。この個体についても同様に、受精後120時間でDietrich固定液を用いて固定しました。この画像は、受精後96時間から120時間まで2%エタノールで処理したことが肝臓に及ぼした影響を示しています。この急性的エタノール処理は、肝ステアトーシスと血管の腫脹を引き起こします。矢印は円形液滴が過剰に蓄積した肝細胞を指し、アスタリスクは腫脹した肝血管を示しています。この手順を行う際は、明暗サイクルが設定された魚類飼育施設でエタノール処理を行うことが重要です。H&E染色の場合は、組織を最適に保存するためにDietrich固定液を使用してください。また、染まりすぎや染め不足を防ぐため、色の濃淡を頻繁に確認することを忘れないでください。

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶ急性アルコール性肝障害の組織学的解析法。Danio rerio幼生を用いて肝脂肪変性と血管腫脹を評価し、人間のアルコール性肝疾患の病態理解に貢献する実験手法を習得する。

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

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