Name: 哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶストレス顆粒の正確な同定法。免疫蛍光とFISHを組み合わせ、ヒト骨肉腫U-2 OS細胞で細胞質叢を分類し、真正なSGを他のフォーカスと区別する手法を解説。

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私はイワノフとアンダーソンのラボのメンバーに、この原稿に関する有益な議論とフィードバックを感謝します。この研究は、ポーランド国立科学センター（UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054からWSへの付与）の国立衛生研究所[PA、NS094918からPIへのGM111700およびCA168872]によって支持された。 WSはまた、ポーランドの科学と高等教育省（モビリティプラスプログラム）とポーランド・アメリカのフルブライト委員会が米国での彼の研究の財政的支援を認めていることも認めています。

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<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
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<li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+%28TDP-43%29+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li>
<li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはない。

複数の疾患における免疫組織学的研究によって証明されるように、慢性ストレスは、異なる細胞内病巣の形成をもたらす。例えば、ほとんどの神経変性疾患は、不溶性タンパク質の細胞内凝集物を特徴とする。このような凝集体中のSG結合タンパク質の存在は、しばしば、そのような病巣がSGであると結論付けるための基礎である。新しいストレス刺激で処理した細胞でSGマーカー陽性細胞質病巣が観察された場合も同様の結論が導かれる。このプロトコルは、 真の SGを識別するための簡単なワークフローを提供します。 組成とダイナミクスの両方の特徴付けを含む、推定SGsがそのように確認されるためのいくつかの基準が満たされなければならない。第1に、SGは翻訳停止したmRNPを含む細胞質の病巣である。したがって、第1のアプローチは、2つの顕微鏡ベースの技術、すなわちポリA-FISHおよびIFを使用してそれらの組成を特徴付けることである。 FISHは視覚的に信頼できる方法ですSGと共局在するmRNAを生成する。オリゴ（dT） 40プローブを用いて、ストレス条件下でSGにパックするポリアデニ...

細胞はストレスに応答するために多くのメカニズムを使用します。いくつかの応答は、転写後レベルで起こり、mRNA翻訳および/または安定性を調節することを含む1,2 。ストレス調節されたmRNAの翻訳停止および分解は、特異的な非膜性細胞巣の形成に関連しており、最もよく特徴づけられているのはストレス顆粒（SGs​​） 3である。 SGは、ストレス（ 例えば、酸化、熱ショック、栄養飢餓、ウイルス感染）に応答して、翻訳拘束細胞に非翻訳mRNPを集中させる細胞質病巣である4 。非翻訳mRNAに加えて、SGは翻訳開始因子、RNA結合タンパク質、および様々なシグナル伝達タンパク質を含む5 。 SGは阻害されたタンパク質翻訳および改変されたRNA代謝のバイオマーカーであり、細胞生存およびアポトーシス、シグナル伝達経路に関連しているs、核プロセス5 。 SGは動的エンティティであり、それらの形成は細胞翻訳6の状態に密接に関連している。一見しっかりした外見にもかかわらず、ほとんどのSGタンパク質成分は、滞留時間が秒で急速に出入りする。 SGは数分から数時間持続しますが、その構成要素のほとんどは急速に変化しています。翻訳開始の阻害およびそれに伴う翻訳ポリソームの解体は、SGの形成を促進する。したがって、SGは翻訳ポリソームと平衡状態にある。このポリソーム/ SG平衡は、 真の SGを他のストレス誘導病巣から区別するための鍵である6,7。 停止開始停止は、mRNA、翻訳開始因子（eIF）、および40Sリボソームサブユニットを含む翻訳コンピテントな開始前複合体の変換を伴う<html> （いわゆる48S *複合体）に翻訳し、SGs 4,6に融合することができる。 SGSは、48S複合体形成の上流の2つの異なる段階で翻訳停止が促進される：キャップ結合eIF4F複合体（ 例えば、そのeIF4Aサブユニットを標的とする）の機能への干渉または翻訳開始因子eIF2のαサブユニットのリン酸化4つのeIF2キナーゼのうちの1つ以上を阻害する。停止した48S複合体（ すなわち、 40Sリボソームサブユニットおよび選択された翻訳開始因子）の存在は、SGs8,9の特徴である。 SGは、ウイルス感染、神経変性、自己免疫、および癌3,10,11,12などの様々な病的状態に関連している。ss = &quot;xref&quot;&gt; 12,13。いくつかのSG成分の変異型は、ニューロンがニューロン死に積極的な役割を果たす細胞内病理学的封入体を示す神経変性疾患（ 例えば、筋萎縮性側索硬化症）と関連している13 。いくつかのウイルスはSG成分をハイジャックしてSGの形成を阻害し、ウイルス複製を増強する14 。最近の研究はまた、化学療法および放射線療法の治療10,16,17,18,19,20の下で、SGを癌15および癌細胞の生存と関連付ける。このような発見はSG生物学に大きな関心を刺激したが、公開された報告の多くは、 真の SGの形成を他のストレス誘発病巣と区別するための重要なコントロールがない。 SGは、T細胞細胞内抗原1（TIA-1）およびポリA結合タンパク質（PABP）を含む、選択されたmRNA結合タンパク質（RBP）からなる非膜性細胞質病巣として最初に記載された。翻訳開始因子;ポリアデニル化mRNA;小型リボソームサブユニット4,6,21,22。伝統的に、それらの組成は、免疫染色および蛍光標識されたタンパク質の異所性発現のような技術によって決定されている23,24。それらの非常に動的な性質のため、SGタンパク質および/またはmRNAの免疫局在化は、SG23,24を検出するための決定的な方法論のままである。今日まで、多くのRBPおよび他のタンパク質（120以上の異なるタンパク質）がSG構成要素11として記載されている。多くのSG-局在タンパク質は、ストレス依存性および独立性の両方でそれらの局在を変化させ、他の細胞内区画および病巣に蓄積することができるので、SGマーカーを選択し、SGを他のタイプのストレス誘発フォーカス。 真正の SGは、mRNA、翻訳開始因子、および小リボソームサブユニットを含み、翻訳と動的平衡にある。 この単純なワークフローは、ストレス誘発病巣が真正 SGであるかどうかを判断するために設計されています。このワークフローには、SGsを研究するために一般的に使用される細胞であるU2OS細胞を使用したいくつかの実験的アプローチが含まれています。これらの細胞は、大きな細胞質を有し、比較的平坦でガラスカバースリップに強く付着するので、理想的である。 SGを研究するために他の細胞タイプを使用することができますが、SG核生成タンパク質のタイミング、薬物濃度、および存在量の違いが動態および成分を変化させることがあることに注意することが重要ですsition。さらに、いくつかの細胞は、細胞表面のブレブを形成することによってパラホルムアルデヒド固定に応答し、次いで、いくつかのSGマーカーの点状局在を引き起こすぎざぎざのような外観を与える。注意深く分析することなく、これらはSGとして誤って分類される可能性があります。これは、ストレス誘発病巣を真正 SGとして同定するために必要なすべての基準を評価する必要性を強調する。 SG22を促進する癌治療薬であるVinorelbine（VRB）と、強固で特徴の良いSG誘導物質であるSodium Arsenite（SA）は、このプロトコルの実験のストレスとして使用されます。 標準的なSGは、細胞質フォーカスにおいて共局在する複数のSGマーカー（タンパク質およびmRNAの両方）を含む。このプロトコルは、タンパク質マーカーおよびポリアデニル化mRNA 22のそれぞれの局在を検出するために、免疫蛍光および蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の両方を使用する。簡単に説明すると、間接免疫蛍光法は、抗体（すなわち、e。一次抗体）を細胞内で検出することができる。次いで、蛍光色素に結合した二次抗体（通常は種特異的）が一次抗体を認識し、標的タンパク質の局在を明らかにする。蛍光顕微鏡法を用いて、細胞内の局在化シグナルを検出する。異なる種で産生された抗体を使用し、異なった色の二次抗体を用いてそれらを検出することにより、複数の抗体の共局在の検出が可能になり、それらのタンパク質標的が同じ場所にあることが示される。 真正 SGで共局在することが確認されているマーカーを選択することが重要です。 FISHは、特定のRNAまたはDNA配列に塩基対合する標識プローブを使用します25 。 mRNAを検出するために、このプロトコールは、mRNAのポリA尾部にハイブリダイズする（または塩基対を形成する）ビオチン化オリゴ（dT） 40プローブ（ すなわち、ポリA FISH）。次いで、ストレプトアビジンはビオチンに対して高い親和性を有するので、ビオチン化プローブは蛍光共役ストレプトアビジンを用いて検出される。 SGを評価する場合、真正SGと同様に、ポリAアフィニティを免疫蛍光法と結合させることが重要であり、両シグナルは共局在すべきである。 このプロトコルを用いて、共局在化は複数の方法で評価される。マルチチャンネル（RGB：赤、緑、青）の画像では、共局在化によって重なった信号の色が変わります（ 例えば、共局在化された赤色と緑色は黄色に見えます）。さらに、各色の強度が所定のライン8,20にわたって測定されるラインスキャン分析を用いて、共局在化を図式的に定量化する。このプロトコルは、ImageJ26を使用する2つのラインスキャン分析手順を記述する。 1つの手順は手動であり、プロセス全体を処理します他のマクロは、マクロを使用するか、手動ステップを自動化する単純なプログラムを使用します。マクロプロシージャを理解するには、手動プログラムを実行することが重要です。 翻訳が抑制されている細胞ではSGが形成される。したがって、SGを有する細胞は、未処理細胞と比較して、全体的翻訳のレベルが低下しているはずである。実験的に、リボプロファイリングが用いられる。ピューロマイシンおよびエメチンは、固定前に短時間細胞に添加され、ピューロマイシンが積極的にポリペプチドを形成するように組み込み、終結を引き起こす27,28。再開始を防ぐには、エメチンによる治療が必要です29 。ピューロマイシンは、抗ピューロマイシン抗体を用いて検出することができ、能動的翻訳のスナップショットを与える。この方法は速く、特定のアミノ酸が欠けている培地でプレ飢餓させる必要がなく（潜在的に細胞にプレストレスをかける）ために使用され、タンパク質翻訳の細胞内局在化。特に、メチオニン類似体L-アジドホモマレイン（AHA）のような修飾アミノ酸類似体を「クリック - イット（click-it）」化学反応30と組み合わせて使用​​する他の方法を用いて、SGを含有する細胞が隣接細胞31よりもはるかに低い翻訳を示すことが示されている31 。しかし、この技術では、メチオニンの飢餓とそれに続く15〜30分間のパルス標識が必要です。メチオニン飢餓はさらなるストレスを構成する一方、長い標識時間（ すなわち 15〜30分）は進行中ではなく累積翻訳の測定をもたらし、また新しく合成されたタンパク質が合成部位から合成部位を最終部位に移動させる細胞。対照的に、リボプロマイシン酸化は非常に速く、グルコース飢餓によってSGを誘導するために使用されるグルコース不含培地などの任意の培地と適合する。 正規のSGは動的平衡状態にある積極的にポリソームを翻訳しています。これは、ポリソームを安定化または不安定化する薬剤でサンプルを処理することにより、SGとポリソーム23との間のバランスを変えることによって、実験的に評価することができる23 。シクロヘキシミド（または同様に作用するエメチン）は、リボソームをmRNA上に「凍結」することによって伸長をブロックし、SGを形成することができる利用可能な非ポリソームのmRNPのプールを減少させる。実験的には、これは2つの方法で使用することができます：ストレスの前にシクロヘキシミド（またはエメチン）を添加してSGの形成を防止するか、またはSGが形成された後にシクロヘキシミド（またはエメチン）予備初期化複合体はポリソーム画分にゆっくり取り込まれる。対照的に、ピューロマイシンは早期終了を引き起こし、ポリソーム分解を促進し、SGに組み立てることができる開始mRNAのプールを増加させる。実験的に、ピューロマイシン治療はSGの数を増加させるか、または閾値を低下させるこれらは、段階的なストレスまたは薬物投与量に応じて形成される。ピューロマイシンの効果を評価する際には、ピューロマイシンが薬剤の効果を増大させ、SGを提示する細胞の割合を増加させることが予想されるので、最大のレベル以下の薬剤を使用することが重要である。 /ストレスは、最初に細胞の100％においてSGを引き起こす。これは、シクロヘキシミド処置と対照的であり、SGを分解し、〜95％の細胞が最初にSGを表示して最大の可能な減少が観察され、正確に定量化されるときに最も効果的である。 このプロトコルは、哺乳動物細胞のSGを研究するための枠組みを提供する。方法は、（1）推定上のSGにおいて古典的なSG関連マーカーeIF4G、eIF3b、およびRas GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）の共局在化を評価するための免疫蛍光染色およびImageJ分析; （2）ポリアデニル化mRNAを検出するためのオリゴ（dT）蛍光in situハイブリダイゼーション（polyA FISH）; （3）ストレス誘発病巣がポリソームと動的平衡状態にあるかどうかを決定するためのシクロヘキシミドおよびピューロマイシン処置; （4）推定上のSGを含有する細胞の翻訳状態を評価するためのリボプロマイシン酸化。一緒に、これらのアッセイは、ストレス誘発病巣が真正 SGとして分類され得るか否かを決定することができる。

<table><tbody><tr><td>U-2 OS ATCC</td><td></td><td>ATCC&reg;HTB-96&トレード;</td><td>一般的には「U2OS」と書かれています 文化は37°Cです。10% FBS/DMEM 中の 5% CO2</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4.5 g/L グルコース、ピルビン酸、フェノール red 10% FBS、10 mM HEPES、ペニシリン/ステプトマイシン プレウォーム先行薬希釈液</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td> 培地 <td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> <td>のサプリメントに使用サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630-080</td><td>培地の補充に使用</td></tr><tr><td>ペニシリン連鎖球菌</td><td>シグマ</td><td>P0781-100ml</td><td>培地の補充に使用</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>ラボティッシュ(キムワイプ)</td>キ<td>ムテックサイエンス</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>成長用カバーガラス カバーグラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-82</td><td>使用前にオートクレーブ滅菌済み 組織培養フード内で無菌状態に保ちます</td></tr><tr><td>亜ヒ酸ナトリウム(メタ)亜ヒ素&ge;90%(SA)</td><td>シグマ</td><td>S7400-100G</td>水<td>に1M濃度まで溶解し、次に100&マイクロに希釈します。M を作業原料として</td></tr><tr><td>ビノレルビン (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td> 水<td>に溶解して 10 mM</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>翻訳レベル(リボプロマイシル化)の評価に使用 -活性翻訳とのSG接続の評価に使用 水で10mg/mLに希釈</td></tr><tr><td>エメチン二塩酸塩水和物</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>一般的な翻訳レベルを評価するためにピューロマイシンと組み合わせて使用 活性翻訳 とのSG接続を評価するために使用されます -水で10 mg/mLに希釈</td></tr> シ<tr><td>クロヘキシミド(CHX)</td><td>シグマ</td><td>C4859</td><td>活性翻訳 水で10 mg/mLに希釈します</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ロンザ / VWR</td><td>95042-486</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>用洗浄緩衝液パラホルムアルデヒド試薬グレード、結晶性(PFA)</td><td>シグマ</td><td>P6148-500G</td><td>ヒュームフード内の高温PBSに4%溶液を作り、溶解するまで攪拌します アリコートは-20°Cで保存できます。C 数ヶ月間 危険、換気を使用 特殊廃棄物に捨て</td></tr>る <tr><td>メタノール、ACS</td><td>BDH/VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>-20°Cに予冷;C 使用前 特殊廃棄物に捨て</td></tr>る <tr><td>通常の馬血清 (NHS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31874</td><td>PBS で5%に希釈 アジ化ナトリウムを4°Cで保存します。C 免疫蛍光用ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>エタノール、ピュア、200プルーフ (100%)、USP、KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>水で70%に希釈</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗 G3BP1 抗体 (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>4 >C 1/100 dilution</td></tr><tr><td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>4 &deg;C 1/250希釈</td></tr><tr><td>ヤギ抗eIF3&eta;(N-20) 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; は eIF3b Store at 4 &deg;C 1/250 希釈</td></tr><tr><td>マウス抗ピューロマイシン 12D10 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MABE343</td><td>4 >C 1/1,000 希釈</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconfigure in water per manufacturer'命令は 4 °C で格納されます。C 1/250 希釈</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>メーカーごとに水に再構成命令は4°Cで保存されます。C 1/2,500 希釈</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>メーカーごとに水で再構成します。命令は4°Cで保存されます。C 1/250 希釈</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 溶液</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>二次抗体 ストック溶液 0.5 mg/mL を dH20 でインキュベートし、光から保護します -4 °C で保存します。C</td></tr><tr><td>Cy3 ストレプトアビジン</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>016-160-084</td><td>メーカーごとに水で再構成sの説明書を作成し、4°Cで保存します。C 1/250 希釈オリ</td></tr><tr><td>ゴ-(dT)40xプローブ ビオチン化</td><td>統合 DNA テクノロジーズ (IDT)/</td><td></td><td>水で 100 ng/mL に再構成し、分注して -20 °C で保存します。C ハイブリデーションバッファーで希釈 使用前に1/50 カスタムオーダー</td></tr><tr><td>ハイブリデーションボックス</td><td>/</td><td>/</td><td>底に加湿紙を追加して、任意の保管スライドボックスを備えたモイスチャーチャンバーを作ります - 使用前にボックスを温める</td></tr><tr><td>20x SSCバッファー</td><td>サーモフィッシャー アンビオン</td><td>AM9763</td><td>RNase フリーウォーターを使用して2x SSCに希釈します フリーウォーター(DEPC処理) RT FISH</td></tr><tr><td>用ウォッシュバッファーで保存してください。PerfectHybPlusハイブリダイゼーションバッファーSigma</td><td></td><td>H7033-50ml</td> FISHスライド封入剤<td>用ブロックおよびプローブインキュベーションバッファー</td></tr>自家製<tr><td></td><td></td><td>/</td><td>5 gの「冷水溶性」PBS の20mLにポリ(ビニルアルコール) 超音波処理により混合し、続いてRT でO / Nを攪拌します5 mLのグリセロールと0.2 mLの20%アジ化ナトリウムを加え、RT で16時間攪拌します 20,000gで20分間遠心分離し、大きなペレット アリコート粘性液体を捨てます。 -20°Cでの長期保管。C、4°Cで1週間。C</td></tr><tr><td>パラフィルム "M"</td><td>シグマ</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(ビニルアルコール)</td><td>シグマ</td><td>P-8136-250G</td><td>ビノールを作る試薬</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>ビノール</td></tr><tr><td>アジドナトリウム</td>を作る試薬 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S2002-5G</td><td>ブロッキング溶液とビノール 水で20%希釈します</td></tr></tbody></table>

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

細胞はしばしば突然の環境変化によって挑戦される。ストレス条件に曝露された細胞内で形成される細胞質リボ核タンパク質複合体であるストレス顆粒（SG）は、細胞代謝および生存の様々な局面に関与している。 SGは、細胞シグナル伝達経路、転写後遺伝子発現およびストレス応答プログラムを調節する。これらのmRNA含有顆粒の形成は細胞翻訳に直接関連する。 SGアセンブリは阻害された翻訳開始によって誘発され、SG分解は翻訳活性化または阻害された翻訳伸長によって促進される。この関係は、SGの構成によってさらに強調される。コアSG成分は、失われた翻訳開始前複合体、mRNA、および選択されたRNA結合タンパク質（RBP）である。 SGアセンブリーの目的は、ストレス応答タンパク質の翻訳の促進を可能にし、翻訳停止したハウスキーピングmRNAを隔離することによって細胞エネルギーを保存することである。アドイティ失われた翻訳予備開始複合体のような核構成要素には、SGは他のタンパク質およびシグナル伝達分子の過剰を含む。 SG形成における欠陥は、ストレスに対する細胞の適応を損ない、細胞死を促進する可能性がある。 SGおよび類似のRNA含有顆粒は、神経変性障害および癌を含む多くのヒト疾患に関連しており、最近RNA顆粒亜型の分類および定義に関心が高まっている。このプロトコールは、哺乳動物SGを特徴づけ、定量するためのアッセイを記載する。

ストレス誘発病巣は必ずしもSGではない。 SGは、mRNA、翻訳開始因子、およびRNA結合タンパク質を含み、活性翻訳と平衡状態にある細胞質病巣として分類される。上記のプロトコルは、与えられたストレスが真正 SGを誘導するかどうかを特徴付けるためのテンプレートとして用いることができる。 SGは、タンパク質およびmRNAの両方を含む他の既知のSGマーカーと共存する。 SAおよびVRBは、G3BP1、eIF4GおよびeIF3bを含む細胞質病巣を誘導する（ 図2A ）。これらのマーカーの共局在化は、ラインスキャン分析および増大した倍率を有する単一チャネル画像を用いて確認される（ 図2A ）。さらに、これらの病巣は、ポリA FISHによって示されるようにMrnaを含み、オリゴ（dT）シグナルはG3BP1免疫蛍光シグナルと共局在する（ 図2B ...

ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフローを記述しています。

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

このワークフローの全体的な目的は、細胞質内で同定されたフォーカスが、細胞生理において重要な役割を果たすRNA顆粒である真正のストレス顆粒であるかどうかを判定することです。このワークフローの主な利点は、ストレス顆粒のあらゆる基本的特性を検証できる点にあります。本ワークフローではヒト骨肉腫U-2 OS細胞を用いて提示していますが、他の種類の細胞株や初代細胞にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、すべてのストレス誘発焦点がストレス顆粒であるわけではないため、判別に苦労することがあります。本ワークフローでは、それらを区別するために必要なすべての実験工程を網羅しています。ここでは、Anais Aulusと共にこの手順を実演します。私たちはPaul AndersonとPavel Ivanovの研究室のポストドクターです。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、24ウェルプレートに配置したカバースリップに細胞を播種します。一晩インキュベートした後、24ウェルプレートのウェルB1からB4、およびC1からC4から培養液を吸引します。100 µMの亜ヒ酸ナトリウムを添加した培地を500 µLずつウェルB1およびB2に加え、次に50 µMの亜ヒ酸ナトリウムを添加した培地を500 µLずつウェルB3およびB4に加えます。続いて、150 µMのビノレルビンを含む培地を500 µLずつウェルC1およびC2に加えます。最後に、125 µMのビノレルビンを添加した培地を500 µLずつウェルC3およびC4に加えます。プレートを37 °Cで30分間インキュベートします。30分間のインキュベーション後、2列目の細胞に1 mg/mLのシクロヘキシミド溶液を5 µL加え、4列目の細胞に1.25 mg/mLのピューロマイシンを2 µL加えます。プレートを静かに振って溶液を混ぜ、さらに30分間インキュベートするためにプレートをインキュベーターに戻します。細胞を固定するために、ウェルから培地を除去し、約250 µLのPBSで細胞を洗浄します。細胞を固定するため、緩衝4%パラホルムアルデヒド溶液を約250 µL加え、カバーガラスの上部が完全に覆われていることを確認します。その後、プレートを室温のベンチロッカーに置き、15分間静置します。次に、パラホルムアルデヒドを除去し、適切に廃棄します。細胞を透過させ、平坦化するために、氷冷したメタノールを約 250 µL 加えます。プレートをロッカースタンドに載せ、室温でさらに 5 分間インキュベートします。透過処理が完了したら、メタノールを除去し、約250 µLのブロッキングバッファーを加えて室温で1時間、細胞をブロッキングします。次に、3 mLのブロッキングバッファーにG3BP1、eIF4G、およびeIF3Bに対する抗体を12 µLずつ加えて、一次抗体溶液を調製します。24ウェルプレートの各ウェルに、抗体溶液を250 µLずつ添加します。プレートをロッカースタンドに置き、室温で1時間以上インキュベートします。1時間のインキュベーション後、抗体溶液を除去し、約250 µLのPBSで5分間細胞を洗浄します。次に、3 mLのブロッキングバッファーに、12 µLのAnti-Mouse Cy2、Anti-Rabbit Cy3、およびAnti-Goat Cy5抗体と3 µLのhooks dyeを加えて、二次抗体溶液を調製します。各ウェルに二次抗体溶液を250 microliters加え、サンプルを遮光するためにプレートに蓋をします。ロッカースタンドを用いて、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、抗体溶液を取り除き、PBSで5分間細胞を洗浄します。封入剤を37 °Cのヒートブロックで10分間加熱し、粘度を下げます。次に、あらかじめカットした200 µL用ピペットチップを用いて、ラベルを貼ったガラススライド上に封入剤を25 µL滴下します。微細ピンセットを使用し、カバーガラスをウェルからスライドへと転送し、細胞面が封入剤に接するように反転させて配置します。清潔なP200チップを使用して、カバーガラスを押しつけます。すべてのカバーガラスの封入が完了したら、ラボティッシュをスライドグラスに強く押し当てて、過剰な封入剤を除去します。その後、スライドグラスを水で洗浄します。直ちに再度ラボ用ティッシュで吸い取ります。室温で氷冷メタノール 250 µL を加え、10 分間インキュベートして、固定済みの細胞を透過処理します。その後、プレートの空いたウェルに 70% エタノールを約 250 µL 加え、蒸発を防ぐためにパラフィルムでプレートを密封します。プレートを4 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、エタノールを除去し、500 µLの2XSSCを加えて細胞を再水和させます。カバースリップを室温のロッカー上で5分間インキュベートします。その後、溶液を捨て、再度500 µLのSSCを加えます。プレートを緩やかに攪拌しながら、さらに5分間インキュベートします。次に、ハイブリダイゼーションオーブンの底にパラフィルムを敷き、その上にハイブリダイゼーションバッファーを25 µLピペッティングします。カバーガラスを24ウェルプレートから移し、細胞側がハイブリダイゼーションバッファーに面するように上向きに反転させます。カバーガラスを42 °Cで15分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションオーブン内のパラフィルム上に、ビオチンoligo dT溶液を25 µL分注します。次に、ピンセットを用いてカバーガラスを取り上げ、エッジ部分をラボティッシュで吸い取り、余分なハイブリダイゼーションバッファーを除去します。細胞面を下にしてカバーガラスをビオチンoligo dT溶液に移し、42 °Cで60分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションが完了したら、24ウェルプレートの各ウェルに、あらかじめ温めておいた2XSSCを約500 µL加えます。次に、ピンセットを用いてカバーガラスをウェルに移し、42°Cで10分間インキュベートします。さらに抗体溶液で細胞を染色した後、蛍光顕微鏡で標本を観察します。ここでは、ストレス顆粒マーカーであるG3BP1、eIF4G、およびeIF3Bで染色された顆粒や焦点が見られない、未処理のU-2 OS細胞の画像を示します。亜ヒ酸ナトリウムまたはヴィノレルビンで処理したU-2 OS細胞において、G3BP1、eIF4G、およびeIF3Bを含む細胞質フォーカスの形成が誘導されました。これらのマーカーの共局在は、各チャンネルに対して高倍率で行ったラインスキャン解析と、得られたグラフの重ね合わせによって確認されました。さらに、処理した細胞で同定された細胞質フォーカスには、poly A FISHで示されるようにmRNAが含まれていました。oligo dTシグナルがG3BP1シグナルと同局化したことで、ストレス顆粒であることが確認されました。習熟すれば、適切に実施することでこのワークフロー全体を3日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、免疫蛍光染色および蛍光ハイブリダイゼーションの実施方法について十分な理解が得られるはずです。ストレス顆粒を正確に特性評価および同定するために不可欠なステップです。パラホルムアルデヒドを取り扱う際は極めて危険な場合があることに留意してください。本手順を実施する際は、個人用保護具（PPE）の使用や十分な換気などの予防策を常に講じてください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Vonaesch, P. ら、 哺乳類細胞の細菌挑戦後のストレス顆粒形成の免疫蛍光解析。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオは、病原性細菌シ ゲラ・フレクスネリ...

がん性上皮細胞の シゲラ 感染による応力顆粒の形成

このビデオでは、mRNA、RNA結合タンパク質(RBP)、およびその他のさまざまなタンパク質で構成される哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量化のためのアッセイを示しています。...

哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量のための免疫蛍光アッセイ

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。...

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ストレス顆粒（SGSは）失速リボ核タンパク質粒子（RNPは）、および様々なストレスに対する細胞応答において重要なを含む細胞質RNAの顆粒である。のSGのダイナミクスは、ストレス後のトランスフェクションした一次細胞内のSGのタグ付けされたコンポーネントの局在を可視化することにより、生細胞で追跡することができます。...

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。...

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

最近、タンパク質のミスフォールディングとタンパク質の静止を研究するシステムとして、社会性アメーバDictyostelium discoideumが確立されました。ここでは、D.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

本発明者らは、細胞が細菌および多数の異なるストレスでチャレンジされた後の哺乳動物細胞におけるストレス顆粒形成の定性的および定量的分析のための方法を記載する。このプロトコルは、広範囲の宿主 - 細菌相互作用における細胞ストレス顆粒応答を調べるために適用することができる。...

哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2...

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

蛍光顕微鏡画像で特定の細胞区画内の細胞体を迅速に探査し、正確に分析するために構築された自由に利用可能なワークフローを提示します。このユーザーフレンドリーなワークフローはオープンソースソフトウェアのIcy上で設計され、また、ImageJの機能を使用しています。パイプラインは、画像解析に関する知識なしに手頃な価格です。...

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。...

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

学ぶストレス顆粒の正確な同定法。免疫蛍光とFISHを組み合わせ、ヒト骨肉腫U-2 OS細胞で細胞質叢を分類し、真正なSGを他のフォーカスと区別する手法を解説。

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

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