哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

このワークフローの全体的な目標は、細胞質内で同定された病巣が、細胞生理学において重要な役割を果たすRNA顆粒である真正なストレス顆粒であるかどうかを判断することです。このワークフローの主な利点は、応力顆粒のすべての基本特性を試験できることです。このワークフローはヒト骨肉腫U-2 OS細胞を対象としていますが、他の種類の細胞株や初代細胞にも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、すべてのストレス誘発病巣がストレス顆粒であるとは限らないため、苦労します。私たちのワークフローは、それらを区別するために必要なすべての実験で構成されています。この手順をAnais Aulusでデモンストレーションします。

私たちは、Paul AndersonとPavel Ivanovの研究室の博士研究員です。まず、テキストプロトコルに記載されているように、24ウェルプレートに配置したカバースリップに細胞を播種します。一晩インキュベーションした後、24ウェルプレートのウェルB1からB4、およびC1からC4に培地を吸引します。

100マイクロモルの亜ヒ酸ナトリウムを補給した培地を500マイクロリットルの培地B1とB2に追加し、次に500マイクロモルの亜ヒ酸ナトリウムを補充した培地をウェルB3とB4に追加します。次に、150マイクロモルのビノレルビンを含む500マイクロリットルの培地をウェルC1とC2に加えます。最後に、125マイクロモルのビノレルビンを補充した500マイクロリットルの培地をウェルC3およびC4に加えます。プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。30分間のインキュベーション後、カラム内の細胞に1ミリグラムあたり1ミリグラムのシクロヘキシミド溶液を2つの5マイクロリットル加え、カラム4の細胞に1ミリリットルあたり1.25ミリグラムのピューロマイシンを2マイクロリットル加えます。プレートを静かに振って溶液を混合し、プレートをインキュベーターに戻してさらに30分間インキュベートします。

細胞を固定するには、ウェルから培地を取り出し、約250マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。約250マイクロリットルの緩衝液4%パラホルムアルデヒド溶液を添加して細胞を固定し、カバーガラスの上部が完全に覆われていることを確認します。次に、プレートをベンチロッカーに室温で15分間放置します。

次に、パラホルムアルデヒドを取り除き、適切に廃棄します。約250マイクロリットルの氷冷メタノールを添加して、細胞を透過化して平らにします。プレートをロッカーで室温でさらに5分間インキュベートします。

透過処理が完了したら、メタノールを廃棄し、室温で約250マイクロリットルのブロッキングバッファーを1時間適用して細胞をブロックします。次に、G3BP1 eIF4GおよびeIF3Bに対する抗体12マイクロリットルを3ミリリットルのブロッキングバッファーに添加して、一次抗体溶液を調製します。24ウェルプレートの各ウェルに250マイクロリットルの抗体溶液を加えます。

プレートをロッカー上で室温で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後1時間後、抗体溶液を取り出し、約250マイクロリットルのPBSで細胞を5分間洗浄します。次に、12マイクロリットルの抗マウスCy2抗体、抗ウサギCy3抗体、および抗ヤギCy5抗体と3マイクロリットルのフック染料を3ミリリットルのブロッキングバッファーに加えて、二次抗体溶液を調製します。

各ウェルに250マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、プレートを覆ってサンプルを光から保護します。プレートをロッカーで室温で1時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、抗体溶液を取り出し、PBSで細胞を5分間洗浄します。

封入剤を摂氏37度のヒートブロックに10分間加熱して、粘度を下げます。次に、あらかじめカットされた200マイクロリットルのピペットチップを使用して、25マイクロリットルの封入剤をラベル付きのスライドガラスに置きます。細かい鉗子を使用して、カバーガラスをウェルからスライドに移し、細胞が封入剤に面するように上部を反転させます。

清潔なP200チップを使用して、カバースリップを押し下げます。すべてのカバースリップを埋込したら、ラボティッシュをスライドにしっかりと押し付けて、余分な封入剤を取り除きます。その後、スライドを水で洗い流します。

そしてすぐにもう一度実験用ティッシュで拭き取ります。接頭辞を付けた細胞を、250マイクロリットルの氷冷メタノールと室温で10分間インキュベートすることにより、透過化します。次に、プレートの空になったウェルに約250マイクロリットルの70%エタノールを加え、パラフィルムを使用してプレートを密封して蒸発を防ぎます。

プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。一晩インキュベートした後、エタノールを除去し、500マイクロリットルの2XSSCを加えて細胞を再水和します。カバースリップをロッカーで室温で5分間インキュベートします。

次に、溶液を廃棄し、500マイクロリットルのSSCをもう一度追加します。プレートをさらに5分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。次に、ハイブリダイゼーションオーブンの底にパラフィルムを重ね、その上に25マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーをピペットで移します。

カバースリップを24ウェルプレートから移し替え、上部を反転させて細胞がハイブリダイゼーションバッファーに面するようにします。カバーガラスを摂氏42度で15分間インキュベートします。25マイクロリットルのビオチンオリゴdT溶液をハイブリダイゼーションオーブンのパラフィルムにピペットで移します。

次に、鉗子を使用してカバーガラスを拾い上げ、その端を実験組織に吸い取り、余分なハイブリダイゼーションバッファーを除去します。カバーガラスをビオチンオリゴdT溶液に移し、細胞が下向きになっていることを確認し、摂氏42度で60分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションが完了したら、約500マイクロリットルの予熱した2XSSCを24ウェルディッシュのウェルに加えます。

次に、鉗子を使用して、カバーガラスをウェルに移し、摂氏42度で10分間インキュベートします。抗体溶液で細胞をさらに染色した後、蛍光顕微鏡で標本を観察します。ここに示されているのは、ストレス顆粒マーカーG3BP1、eIF4G、およびeIF3Bで染色された顆粒または病巣を含まない未処理のU-2 OS細胞の画像です。

亜ヒ酸ナトリウムまたはビノレルビンで処理したU-2 OS細胞では、G3BP1、eIF4G、およびeIF3Bを含む細胞質病巣の形成が誘導されました。これらのマーカーの共局在は、各チャンネルに対して拡大倍率でラインスキャン分析を行い、その後、得られたグラフを重ね合わせて確認しました。さらに、処理した細胞で同定された細胞質病巣は、poly A FISHで示されるようにmRNAを含んでいました。

オリゴdTシグナルはG3BP1シグナルと共局在し、ストレス顆粒の同定を確認しました。一度マスターすれば、このワークフロー全体は、適切に実行されれば3日で完了することができます。このビデオを見れば、免疫蛍光法と蛍光ハイブリダイゼーションの実施方法について十分に理解できるはずです。

応力顆粒の正しい特性評価と同定に不可欠なステップ。パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、PPEの使用や適切な換気などの予防措置を常に使用する必要があります。