腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

この方法の全体的な目標は、混合マウス腸細胞を単離して培養し、腸内分泌細胞の腸内分泌細胞の腸ペプチド分泌と生細胞イメージングの研究を可能にすることです。私たちはもともと、腸内分泌細胞のin vitro特性評価を可能にするためにこの方法を開発しました。腸内分泌細胞は腸の内容物を監視し、体の恒常性を調節します。

しかし、それらは腸上皮全体に散らばっているため、研究が困難でした。ここで説明するカルシスは、腸内分泌細胞の遺伝的蛍光標識と組み合わせると、シングルセルの電気生理学的および生細胞イメージング技術の使用を可能にするため、特に有用です。手順をデモンストレーションするのは、私たちの研究室の術後であるシェリル・ブライトンです。

まず、単離されたマウス十二指腸をPBSで満たされた10センチメートルのシャーレに移します。鉗子を使用して、腸の断片の一方の端を慎重につかみ、パスツールピペットの先端をその内腔に導入します。その後、冷やしたPBSで腸内内容物を洗い流します。

内容物の大部分が除去されるまで、腸の両端について繰り返します。すすいだ腸を、新鮮な冷やしたPBSで満たされたきれいなペトリ皿に移します。解剖顕微鏡で、脂肪組織と腸内膜を腸片から取り除き、筋肉層が剥がれるのを防ぎます。

次に、組織の近位端にある筋層のフラップを特定します。次に、2セットの細かい前傘を使用して、腸の周りの層全体を少量ゆっくりと引き離します。腸と筋肉フラップをできるだけ多くつかみ、層をゆっくりと引き離して、腸の周りから筋肉層を剥がし始めます。

鉗子を互いに近づけて、筋肉層と上皮が裂けるのを防ぎます。腸片の全長から筋肉層を取り除きます。その後、腸を縦に切って開き、新鮮な冷やしたPBSが入ったきれいなシャーレに移します。

ティッシュを攪拌して、残っているチャイムや粘液を洗い流します。洗浄したら、外科用メスの刃で組織を切断し、約1〜2平方ミリメートルの正方形にします。次に、先端が事前にカットされたパスツールピペットを使用して、得られた断片を約20ミリリットルの冷却PBSで満たされた50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

チューブを静かに振って組織の破片をさらに洗い、組織を沈殿させます。組織が落ち着いたら、ほとんどのPBSを吸引し、サンプルを新しいPBSでもう一度洗浄します。腸を消化するには、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織片を冷却した滅菌DMEMを含む滅菌50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、懸濁液を渦巻き、組織を沈降させてから培地を取り除きます。

7ミリリットルの消化培地を組織片に加え、懸濁液を渦巻かせます。懸濁液を摂氏37度の水浴中で5分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを約3秒間静かに振ってください。

未消化の組織を沈殿させ、消化培地を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。誤って採取した組織を沈降させ、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、未消化の組織が入った15ミリリットルの遠心分離チューブに戻します。顕微鏡観察のために少量の消化培地を保存し、残りは廃棄します。

光学顕微鏡で消化媒体の内容物を監視し、懸濁液に多くの陰窩が含まれていないことを確認します。次に、7ミリリットルの新鮮な消化培地を追加し、もう一度消化手順を実行します。陰窩フラグメント懸濁液を調製するには、腸フラグメントに7ミリリットルの新鮮な消化培地を追加します。

組織を摂氏37度の水で10分間インキュベートします。今回は5分ごとに、サンプルをより長く、より激しく振とうします。未消化の組織を沈殿させ、消化培地を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

誤って採取した組織を沈降させ、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、未消化の組織が入った50ミリリットルの遠心分離チューブに戻します。腸の断片に7ミリリットルの新鮮な消化培地を追加し、次の消化を開始します。次に、前の消化物から回収した培地を100 x gで室温で3分間遠心分離します。

スーパーナテントを廃棄した後、穏やかにピペッティングすることにより、予熱した培地の5ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。次に、サンプルを脇に置き、細胞懸濁液の少量のアリコートを採取します。光学顕微鏡下で、サンプルに分離された陰窩の断片が含まれていることを確認します。

組織の消化をさらに2〜3回、または組織の大部分が消化されるまで繰り返します。消化物上清が収集されたら、それらすべてを結合し、サンプルを100x gでトゥーム温度で3分間遠心分離します。上清を捨て、塊が見えなくなるまで穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁し、5ミリリットルの予熱した培地に10マイクロモルのY-27632を補充して、アノイキを防ぎます。

最後に、細胞懸濁液を100ミクロンのフィルターでろ過し、未消化の組織をすべて除去します。Y-27632を添加した予め温めた培地をさらに2ミリリットルでフィルターを洗浄します。細胞を播種する前に、基底膜マトリックスでコーティングされたプレートをインキュベーターから取り出します。

プレートから余分な基底膜マトリックス溶液を取り除き、10マイクロモルのY-27632を添加した予熱した培地250マイクロリットルを各ウェルに加えます。24ウェルプレートのウェルあたり250マイクロリットルの細胞懸濁液をシードし、ゆっくりとジグザグに行う滴下ピペッティングによる。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。

ここに示されているのは、培養の18〜24時間後に撮影された初代小腸細胞の単層の顕微鏡画像です。in vitroで培養した初代小腸細胞は、細胞内カルシウムを上昇させる刺激、またはサイクリックAMPに応答し、細胞をボンベシンで処理するとグルカゴン様ペプチド-1の放出が2倍に増加し、フォルスコリンとIBMXと同時に刺激すると11倍の分泌増強をもたらしました。最後に、プログルカゴンプロモーターの制御下でGCAMP3を発現するトランスジェニックマウスから作製した培養物を用いて、初代小腸L細胞がボンベシンおよび塩化カリウム刺激に応答し、細胞質ゾルカルシウムの増加を伴い、蛍光の増強によって示されることが示された。

実証された手順は、多くのラップが困難であることが判明した培養小腸細胞に焦点を当てています。また、マウス由来とヒト由来の両方の他の腸管の培養にも同様の実用薬を使用しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間で完了できます。

同じ製剤は2つとないため、顕微鏡下で各消化物のアリコートを検査することを忘れないようにすることが重要です。これにより、進行状況を評価し、それに応じて揺れの強度と消化回数を調整できます。