Name: 腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶマウス小腸混合初代培養法による腸内分泌細胞の生細胞イメージングと腸ペプチド分泌メカニズムの研究手法。この方法は遺伝子蛍光標識と組み合わせて単一細胞電気生理学解析にも応用可能です。

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GLP-1免疫アッセイはAddenbrooke病院におけるコア生化学アッセイ研究所によって行われました。 この作品は、長年にわたって、ウェルカムトラストによって支えられてきた（現在アクティブな助成金106262 / Z / 14 / Zおよび106263 / Z / 14 / Z）と医学研究評議会（MRC）（助成金MRC_MC_UU_12012 / 3およびMRC_MC_UU_12012 / 5）。

すべての動物の手順は、ケンブリッジ動物福祉の大学と倫理レビューボディによって承認され、（科学的処置）法1986年改正規則（SI 3039分の2012）を動物に適合しました。 予め1.準備<ol><li>解凍する氷の上基底膜マトリックスの一部（BMM）（〜200μL）を配置します。 注：BMMは、室温（RT）で凝固します。 </li><li>プレ暖かい50mLの無菌高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（添加なしで）及び〜10％ウシ胎児血清（FBSを補充した40mLの滅菌培地（高グルコースDMEM）、100 U / mLペニシリン及び0.1mg / mlのストレプトマイシン（P / S）、および2mM L-グルタミン）37 O℃で水浴中で50mLの遠心管に</li><li>プレ冷却カルシウム及びマグネシウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> 15 mgのコラゲナーゼ（XI粗製）を秤量、50mLの遠心管に加え、氷上に保ちます。 <ol><lI&gt;注意：コラゲナーゼは有害です。これは、皮膚刺激（H315）と強い眼刺激（H319）を引き起こします。 （H334）吸入する場合には、アレルギー、喘息または、呼吸困難を引き起こす可能性があります。これは、呼吸器への刺激（H335）を引き起こす可能性があります。 、適切な個人保護具を使用するダスト形成を避け、ほこりの吸入を避けます。十分な換気を確認してください。 </li></ol></li></ol> 2.組織収集<ol><li> 50 mLの遠心分離管に〜20mLのL-15培地を追加し、氷の上に置きます。 </li><li>頸椎脱臼、またはその他の承認されたスケジュール1の方法により、マウスを安楽死させます。 注：腸組織は、通常C57BL6背景上のマウスから得られます。しかし、他の遺伝的背景はまた、129 / SvEv 15 例えば使用されています。イメージング実験は、 例えば GLU-金星1蛍光レポーターマウスを使用する必要があります。組織は、両性の成体マウス（2-6ヶ月）から取得されます。マウスはindividua内に収容されています水と通常の飼料に自由摂取アクセス LLY-換気ケージ。プロジェクトのライセンスでサポートされている場合は、腸内分泌細胞機能16に、例えば、高脂肪食の効果をテストするための実験を行うことができます。 </li><li>解剖穏やか鉗子と解剖ハサミを使用して（直腸開始する幽門から）マウスの腸を除去します。使用する準備ができるまで氷上にL-15培地中に保管してください。 </li></ol> 3.組織調製<ol><li>組織をカバーするのに十分なPBSを含有する10cmのペトリ皿に腸組織を置きます。 （幽門から遠位例えば上部小腸、上位10 cmの）所望の組織10センチ取ります。 </li><li> プラスチック製パスツールピペット、冷却PBSを用いて腸内容物を洗い流します。 <ol><li>微妙グリップ、腸のセグメントの一端を鉗子を使用して、そこにパスツールピペットの先端を配置します。冷却PBSとの内容をフラッシュします。魔女になるまで両端から繰り返し内容のrityが出てフラッシュされています。新鮮なチルドPBSを含む清潔なペトリ皿に移します。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、同時に筋層をやってのけるないように注意しながら、脂肪組織および腸間膜を削除します。 </li><li> ピール筋肉が細かい鉗子の2セットを使用して解剖顕微鏡下で、「靴下のように」オフ層。 注：この手順は必須ではないが、強くお勧めします。ここで説明したものに、筋層を除去する別の方法があります。例えば、腸前筋層の除去に、長手方向に第一切開することができます。 <ol><li>筋肉の可視フラップが存在する組織のより近位端に開始点を見つけます。静かに腸の周りのすべての道筋層の少量を引き離します。 注：筋層または腸上皮の引き裂きを回避するために、より大きな表面積をクランプするのではなく、Tを使用して張力を減少させます細かい鉗子のIPS。 </li><li>引き離すと腸の周りの筋肉層を剥離開始優しく、腸をクランプし、可能な限り筋肉フラップの同じくらい。筋層と上皮の両方を引き裂く回避するために、一緒に閉じそれらを保つために鉗子の位置を再調整キープ。このようにして、腸のセグメント及び廃棄の全体の長さから筋肉層を除去します。 </li></ol></li><li>縦方向に開いた腸を切断し、新鮮な冷蔵PBSで清潔なペトリ皿に旋回することによって洗浄します。必要に応じて、残りの消化粥や粘液を取り除くために繰り返します。 </li><li> 〜1〜2ミリメートル2の正方形を達成し、〜20 mLにこれらを追加するために外科用メスの刃でミンチ組織をパスツールピペットを用いて50mLの遠心管中でPBSを冷却しました。ピペットに付着組織片を回避するために、先端部を切断し、PBSを用いて粉砕することによりピペットを濡らします。 </li><li>静かに、さらに組織片を洗浄するためにチューブを振ります。組織が落ち着くと注ぐことを許可またはpPBSの大部分をオフipetteし、PBSが明確に見えるまで、新鮮なPBSで繰り返します。 </li></ol> BBMコートプレート/皿、消化中の4の調製 注：以下の手順は、（37℃の水浴中でインキュベーション工程を有する）組織培養フード内で行われるべきです。 <ol><li> （無添加で）冷却されたDMEM中2％BMM溶液を調製します。仕事をしながら、氷の上で解決策を維持します。 2％溶液のために、140μLを加える7 mLのDMEM（単一の24ウェルプレートを調製するのに十分）にBMMを解凍しました。 <ol><li> 250μLの2％BMMウェルあたり溶液（24ウェルプレート）またはガラスボトム撮像皿当たり加えます。 </li><li> BMMの十分な重合を可能にするために37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間コーティングしたプレート/皿をインキュベートします。 </li></ol></li><li> 0.3 mg / mlとの溶液を形成し、溶解させるために反転させる（ステップ1.2および1.4からの）15 mgのコラゲナーゼに（無添加で）50mLの予め温めておいたDMEMを加えます。 <ol><li>にCEは、完全に新しい無菌50mL遠心管に0.2μmの無菌フィルターを通してコラゲナーゼ溶液を濾過、20mlの注射器を使用して、溶解しました。消化媒体として、このラベルを付けます。 </li></ol></li></ol> 5.組織消化<ol><li> 10mLの血清学的ピペットを用いてPBSから組織片を除去し、（無添加で）冷蔵滅菌DMEMを含有する無菌の50mLの遠心管に追加し、旋回した後、DMEMを除去します。 注：組織との接触前にDME​​Mで粉砕して、それを濡らし、血清ピペットに付着した組織を避けるために。 </li><li> 「ダイジェスト」1と2：細胞破片の除去および単一細胞 <ol><li>組織片に7 mLの消化培地を追加し、チューブにスワールを与えます。 </li><li> 37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 </li><li>優しく（旋回ない）〜3秒のためのチューブを振ります。 </li><li>予約、組織を消化培地を解決し、破棄することを許可します顕微鏡で見て、小容量。 注：始めたときに特に、非常に消化プロセスの進捗状況を測定するために顕微鏡下で各「ダイジェスト」（〜30μL）の少量を検査することが推奨されます。多くの陰窩は、この段階で観察されている場合は、振とうしながらも活発かもしれません。異なる「ダイジェスト」のステージは、一般的にどのように見えるかの代表的な画像については、 図1を参照してください。 </li><li> （新鮮な消化培地で）ステップ5.2.-5.2.4を繰り返します。 </li></ol></li><li> 「ダイジェスト」3〜5：暗号断片のコレクション <ol><li>組織に7 mLの消化培地を追加します。 </li><li> 37℃で10分間インキュベートします。 <ol><li>インキュベーションの間、10〜12秒ごとに5分を振ります。 注：に振盪は「ダイジェスト」1と2振とうよりも活発です。 </li></ol></li><li>未消化組織は15mLの遠心分離管に消化培地を解決し、収集することを可能にします。もし組織が誤って媒体と共に、それは、沈降10mLの血清学的ピペットを使用して除去し、未消化組織を含む50mLの遠心分離管に戻ってそれを転送することを可能に収集されます。 </li><li>遠心分離は、100×gで3分間RTで培地/上清を収集しました。 </li><li>上清を捨て、穏やかな粉砕及び取り分けによって5mLの予め温めた培地に細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>顕微鏡下での細胞懸濁液の少量を検査する（ステップ5.2.4からの注を参照）。 注：理想的には、暗号の断片は「ダイジェスト」3細胞の破片や単一細胞と一緒に表示されるように始めます。 「ダイジェスト」4及び5は、低減細胞破片と陰窩フラグメントの有意に大きな数を含む（ 図1）。組織が消化されていないと暗号フラグメントが表示されない場合は、より積極的に振るすなわち 、必要に応じて強度を振って調整します。 </li><li>手順を繰り返し5.3.1-5.3.6 5まで、「ダイジェスト」はされています完了または組織の大部分が消化されるまで（6 番目のダイジェストが必要とされ得ます）。 </li><li>一度「ダイジェスト」3-5（又は3-6）収集された、遠心機から全ての上清を100×gで3分間RTで上清を消化します。 </li><li>分泌実験のために、遠心分離の前に「ダイジェスト」3-5（または3-6）からの上清を兼ね備えています。 注：あまり組織をイメージング実験のために必要とされ、したがって、暗号フラグメントの数が多いクリーン（細胞デブリと単一細胞の非存在下）でダイジェスト上清を選択してください。これは典型的には4または5「ダイジェスト」。 </li><li>上清を捨て、穏やかない塊が見えなくなるまで粉砕することによりペレットを再懸濁。再懸濁10μMのY-27632二塩酸塩を補充予め温めた培地にペレットを（アノイキス17を防ぐため）。イメージング実験のために分泌実験のために5 mLおよび2mLの培地を使用します。 </li><li>フィルタ100-μmのフィルターを通して細胞懸濁液（任意の未消化組織を除去するため）。 （：それぞれ、分泌および画像化のために7 mLおよび4mLの総容量）を洗浄するためのフィルターを通して予め温めた培地のさらなる2mLの実行。 注：フィルタリングは必須ではないが、しかし、より大きな組織片は、プレート/皿に付着しない傾向があります。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> 図1：プライマリ小腸培養法から「ダイジェスト」の代表的な画像。 「ダイジェスト」1および2は、主に単一の細胞および細胞残屑を含むから、（A）は、典型的な材料。 （B）黒矢印3.「ダイジェスト」から製品の例は、ダイジェスト材料に現れる陰窩の断片を示します。 「ダイジェスト」4または5パネル（D）の代表的な（C）は、から材料を消化プール表します「ダイジェスト」3-5（C）に見られる大きな望ましくない組織片を除去するために100μmのフィルターに通しました。すべての画像は20X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて撮影しました。スケールバー=100μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 前記メッキ腸培養（陰窩細胞について富化） <ol><li>プレートまたは皿から過剰BMM溶液を除去し、ウェル分泌あたり250μLの予め温めた培地を加えます。 注：イメージング料理はとても迅速に次のステップに進んで乾燥から皿を防止するために、媒体なしで残されます。 </li><li> プレート250μLの細胞懸濁液をウェルあたり（24ウェルプレート）またはガラスボトムディッシュあたり。 <ol><li>プレート滴下遅い「ジグザグ」を運動でも越え。暗号フラグメントが目にプレートを移動する前に〜5分間沈降することを許可します電子インキュベーター。 注：これはウェル内陰窩/細胞の均一な分布を奨励すべきです。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩プレート又は皿をインキュベートし、5％CO 2。 注：「まだら」単層が形成されている必要があります。 3回の洗浄の後に培養物の代表的な画像のために、 図2Aを参照。 </li><li>皿当たり2mLの予め温めた培地と「洪水」撮像料理。 注：これらの料理は、メッキ以下まで〜72時間イメージングのために適しているであろう。結腸培養は、通常、7日までに、長く続きます。付着しなかった細胞は洗浄工程によって除去することができます。初代培養は、今の実験のために使用される準備ができています。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

このプロトコルは、消化管ペプチドの分泌および標識腸内分泌細胞の単一細胞イメージングの研究を可能にするために、混合ネズミ小腸の細胞の単離および培養を記載しています。 小腸培養は成功している可能性を高めるためには、プロトコルが可能なように（理想的には、組織採取の3時間以内）と組織を前氷冷培地または緩衝液中で維持されるよう迅速に行われることが重要です消化プロセスに、細胞死を制限します。それは、特に結腸の文化のために、必須ではないが、小腸からの筋層の除去が強く推奨されます。小腸培養プロトコルは、可能な限り標準化されています。しかし、消化プロセスが同一ではないことに注意することが重要です。変動は、筋肉の除去の程度EG日常的に導入することができるこのプロトコル中の多くのステップは、トンの大きさがあります彼は、揺れの強さ、コラゲナーゼなどの特定のバッチの効力を組織片「を刻みました」。これは、異なる各々のアリコートを検査するために最も重要である。したがって、それに応じて消化プロセスの進捗及びテーラー振盪及び「ダイジェスト」の数を評価するために顕微鏡下で「消化します」。暗号フラグメントは、より積極的に揺れを開始し、3年以降「ダイジェスト」から明らかでない場合は、で始まるとするより優しく振ることをお勧めします。 私たちの経験から、腸内分泌細胞は、培養中で増殖しないと、通常は4日以内に小腸培養物から失われています。それにもかかわらず、これは、生理的刺激及び/又は薬剤を試験するために（典型的には2時間、18〜24時間後にメッキにわたって行わ）十分な時間が腸ペプチド分泌実験を行うことを可能にします。分泌実験前に一晩のインキュベーションを必要とする実験も実現可能であるなど百日咳毒素15による前処理の場合です。 ここで紹介する初代培養技術は、それが年間で生産している研究成果の量によって証明されるように、十分に確立された方法です。初代培養モデルは、多様な栄養素および非栄養14、20回の刺激および阻害剤に応答して、GLP-1、GIP 18およびPYY 19を含む腸ペプチドの種々の分泌を研究するために使用されてきました。また、同じ技術は、正常ヒト腸細胞21の培養に適用されています。多くの場合、追加の実験モデルなどとともに初代細胞培養法の組み合わせ。 エキソビボまたはインビボにおいては、ほとんどの洞察6を提供することができます。特に他の方法とは対照的に、この技術は、IMを持っています腸ペプチド放出の測定を超えportantアプリケーション。我々は、トランスジェニックレポーターマウス由来の初代小腸培養は、例えば、それぞれのCa 2+およびcAMPセンサー、GCaMP3 11、13及びEpac2camps 14を用いて、消化管ペプチドの分泌に結合された細胞内シグナル伝達経路の問い合わせのための強力なツールであることを実証していますだけでなく、電気生理学的手法12。 全てのin vitroモデルと同様に、一次腸の培養物は、培養中の上皮細胞の極性の喪失、ならびに血液供給と神経支配の喪失を含む特定の固有の限界を有しています。腸内分泌細胞機能に対するこれらの人工的な条件の潜在的な影響を推定することは困難です。しかし、初代培養から得られたデータは、多くの場合、in vivoで settiに翻訳可能となっていますNG（GLP-1分泌15の短鎖脂肪酸の例効果）。 主な腸の培養は、多くの潜在的な用途で汎用性の高い技術です。彼らはすでに腸ペプチド分泌の調節に重要なメカニズムの洞察を提供しています。

この方法の全体的な目標は、腸ペプチド分泌と腸内分泌細胞の生細胞イメージングの研究を可能にするために、混合ネズミ腸細胞を分離し、文化です。この手順の初期のバージョンは、もともとライマンらによって2008年に出版されました。 1、以来、私たちのグループからさらに20本の出版物の基礎を形成しています。この原稿のために、我々は、彼らが結腸の文化よりも確立するより挑戦しているよう小腸の文化に焦点を当てることにしました。 腸内分泌細胞は、グルコース依存性ペプチド（GIP）、コレシストキニン（CCK）およびペプチドYY（PYY）2インスリン分泌、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）を含めた腸ペプチドの配列を分泌します。これらの消化管ペプチドは、腸の輸送の遅延として食後応答を組織にグルコース刺激インスリン放出および満腹感の誘導の増強を重要な生理的役割を果たしています。 GLP-1模倣物ANDその分解を阻害する薬物は、現在、2型糖尿病の治療のために認可されており、このペプチド3の内因性の分泌を刺激する治療的可能性の継続的な評価があります。腸内分泌生理学のより良い理解及び分泌が刺激または阻害されるかれるメカニズムは、非常に重要で、従って、です。 ペプチドの分泌は、インビトロおよびエクスビボ実験モデル、利点と欠点を有するそれぞれのさまざまな方法を使って研究することができる腸（また、in vivoモデルの使用をカバーする包括的な最近の総説についてはSvendsen ら 4を参照）。そのような単離された灌流腸5とウッシングチャンバ6としてエクスビボ技術は、現在、種々の物質に応答して腸ペプチド分泌を探索するために使用されています。これらのメソッドの主な利点として、初代培養物と比較して、腸内分泌細胞の直接の環境はほとんど無傷のままで、重要なのは、細胞の極性が保存されていることです。したがって、分泌6に作用される細胞表面に関する情報を引き出すことが可能です。しかし、これらは一般的に、低スループット技術であり、それらから得られたデータの品質は必然的に時間をかけて低下し、腸組織の完全性と実行可能性に大きく依存しています。 腸オルガノイドは今、ますます腸内分泌細胞機能と開発7の研究のためのin vitroモデルとして使用されています。マウスおよびヒト組織の両方に由来することができるオルガノイドは、培養中の細胞極性を維持3D「陰窩様」構造を形成するという利点を有します。しかしながら、オルガノイド由来の腸内分泌細胞は、まだ完全には特徴付けされなければならないとネイティブLのCELに対するそれらの類似性LSはほとんど不明のまま。初代培養物は、腸内分泌細胞は長期間にわたって人工条件下で維持し、分化していないとして、ステップ近い生理学的設定にあるという利点を有します。 腸ペプチド分泌の評価のために使用されてきた別の初代培養方法は、胎児ラットの腸細胞（FRICs）8の単離であります。しかし、成人の腸組織の文化はあまり成功していると、いくつかの違いがFRICs 対大人のマウスの腸細胞（ 例えば 、グルコース8）の応答で観察されています。 腸内分泌様細胞株（ 例えば GLUTag、STC-1およびNCI-H716）は、伝統的に対直接区別するために使用されています。間接的な影響腸内分泌細胞上および分泌に刺激を結合根底にある分子メカニズムを分析します。 Kuhre らを参照してください</em&gt;。 「Lセル状」不死化細胞株によるペプチド産生および分泌のための9。消化管に沿って点在腸内分泌細胞は、腸管上皮細胞10と分類された細胞のすぐ下に1％を占めているので、これは私たちの手の中に、文化1で生存しない、必要がありました。細胞株は、彼らがそのような遺伝子サイレンシングなどの遺伝子操作を助長している、主に均一な細胞集団であるという事実のために便利なツール残ります。したがって、トランスジェニックマウスが利用できない場合、薬理学的に標的にすることができないタンパク質の役割を調査することは容易です。しかし、細胞株は、常にプライマリ細胞の有効なモデルではありません。多くの類似点がありますが、初代培養からの調査結果は、機会に例えば （例えば、GLUTag細胞と比較して主L細胞内の特定の栄養素によって活性化されるシグナル伝達経路の違いを強調している。ペプトン&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 11）。決定的に、トランスジェニック蛍光レポーターマウスと組み合わせて、初代培養モデルは、細胞内レベルで個々の一次腸内分泌細胞の詳細な検査を可能にします。初代培養物内蛍光標識L細胞は1、12件の研究、および単一細胞カルシウム11、13及びサイクリックアデノシン一リン酸-FRETイメージング腸内分泌の分野における重要な進歩をもたらしてきた14件の研究を、クランプパッチのための私達のグループによって使用されています生理。 以下のプロトコルは、24ウェルプレートを用いて、分泌実験を行うために最適化された、または単一成体マウスからの小腸の10cmの部分から最大16枚の撮像皿の調製のためのものです。プロトコルは、簡単に消化時間を増加させることにより結腸細胞の研究や共同のために変更することができますllagenase濃度。

<table><tbody><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>分泌実験用</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>ポジティブコントロール(カルシウムイメージング実験)</td></tr><tr><td>遠心分離チューブ、15 mL、滅菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>組織調製/消化用</td></tr><tr><td>遠心分離チューブ、50 mL、滅菌</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>430828</td><td>組織調製/消化用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ XI(粗)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>消化培地を作るため</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>ケアン研究</td><td>-</td><td>イメージング実験用</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>マトリゲルを溶解するため (4°C;消化媒体を作るために、37°Cに予熱します。</td></tr><tr><td>蛍光フィルター(帯域幅510-560nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>イメージング実験用</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>培養培地の調製用</td></tr><tr><td>鉗子/ピンセット</td><td>寒天科学</td><td>AGT520</td><td>腸の解剖/除去用</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>ポジティブコントロール(分泌実験)</td></tr><tr><td>ガラス底皿(35mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>イメージング実験用</td></tr><tr><td>高精度ピンセット(110mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>筋肉層除去用</td></tr><tr><td>高解像度デジタルCCDカメラ</td><td>浜松</td><td>ORCA-ER</td><td>イメージング実験用</td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>ポジティブコントロール(分泌実験)</td></tr><tr><td>L-15 メディウム (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>組織を採取し、氷上に保管する</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>培地のメイ</td></tr><tr><td>トリゲル&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>基底膜マトリックス、コーティングプレートおよびディッシュ用</td></tr><tr><td>MetaFluor&nbsp;</td><td>Molecular Devices(Cairn Research社提供)</td><td>-</td><td>蛍光比イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>マウス(C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>育種に使用した背景マウスです。分泌実験にも使用できます</td></tr><tr><td>マウス(GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>家-</td><td></td><td>カルシウムイメージングおよび分泌実験用</td></tr><tr><td>顕微鏡(EVOS XL Core)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>AMEX1000</td><td>培養顕微鏡の写真撮影用</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td>イメージング実験に使用される40倍オイル対物レンズ付き倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>モノクロメーター</td><td>ケアン研究</td><td></td><td>-イメージング実験</td></tr><tr><td>用 パスツールピペット</td><td>アルファラボラトリ</td>ーズ <td>LW4234</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+およびMg2+</supを含む組織PBSの</td>洗浄用><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td> 組織<td>を洗浄するために、氷上に置いてください</td></tr><tr><td>ペニシリン&ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>培地の調製用</td></tr><tr><td>ペトリ皿(100mm×20mm)</td>コー<td>ニング</td><td>CLS430167</td><td>組織の洗浄と筋肉層の除去用</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P/4280/53</td><td>ポジティブコントロール(カルシウムイメージング実験)</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>寒天培</td>地 <td>AGT554</td><td>腸の解剖・除去用</td></tr><tr><td>滅菌セルストレーナー 100 & micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>めっき前に陰窩細胞懸濁液をろ過するため</td></tr><tr><td>外科用メスブレード No.22 (滅菌、ステンレス)</td> <td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>組織ダイシング用</td></tr><tr><td>シリンジフィルター、Minisart NML (0.2 & micro;m孔径)</td><td>ザルトリウス</td><td>16534-K</td><td>コラゲナーゼ溶液(消化媒体)シ</td></tr><tr><td>リンジ、20mL、使い捨て、滅菌、ルアースリップ</td><td></td><td>BD 300613</td>フィルター<td>滅菌コラゲナーゼ溶液(消化媒体)キ</td></tr><tr><td>セノンアークランプ75W</td><td>ケアン研究</td><td>-</td><td>イメージング実験</td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>トクリス</td><td>1254</td><td>ROCK阻害剤、滅菌水で10 mMストック溶液を調製(最終培地で1:1,000を使用)</td></tr></tbody></table>

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

腸は、消化管上皮の長さに沿って配置ホルモン分泌腸内分泌細胞と体の最大の内分泌器官です。それらの生理学的重要性にもかかわらず、腸内分泌細胞は、上皮細胞集団のごく一部を表しており、過去には、その特性は、細胞株モデルへの依存度が得られ、かなりの挑戦を提示しています。ここで、我々は、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養のための詳細なプロトコルを提供します。これらの一次培養物を栄養および神経ペプチドの数、ならびに薬理学的薬剤に応答して腸ペプチド分泌の刺激および阻害の根底にあるシグナル伝達経路を同定するために使用されてきました。さらに、トランスジェニック蛍光レポーターマウスの使用との組み合わせで、我々はこれらの初代培養物が中に蛍光タグ付き腸内分泌細胞の検査のための強力なツールとなっていることを証明しましたそのようなパッチクランプ及び単一細胞カルシウムおよびcAMP-FRETイメージングなどの方法を用いてtracellularレベル、。

シリアル消化工程の使用は、暗号フラグメントの比較的きれいな準備のコレクションは実験のためにメッキすることができます。最初の2回のダイジェストが消化物質（ 図1A）から主に単一の細胞および細胞残屑を除去します。第三の消化中、陰窩断片を消化物質（ 図1B）に表示されます。少数の単一細胞（ 図1C）と、図4及び図5収量陰窩断片のより多くを消化します。消化物3-5からプールした物質を濾過して清浄な陰窩断片調製物（ 図1D）を製造、培養に有害であり得る、未消化組織のより大きな部分を除去します。 培養の18〜24時間後に、一次小腸細胞の単層を（ 図2A）が観察されます。具体的には、CALを発現するトランスジェニックマウスから生成された培養物を用いてcium蛍光センサー、GCaMP3は、プログルカゴンプロモーター11の制御下で、L細胞を容易に同定および培養（ 図2B）内に散在しています。プライマリ小腸培養物において、化合物は、G、Q -Caを標的2+ IおよびcAMP iは経路がGLP-1の分泌を刺激依存性（分泌実験方法のためライマンら 。1参照）。ボンベシン（BBS、100 nm）を、フォルスコリンの同時適用及び3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）（F / I、10μMそれぞれは）、のGLP-1放出に対する刺激を2-および11倍誘発さ基礎であった（ 図2C）。 GCaMP3の特定L細胞発現は、識別及び個々のL細胞内カルシウム動員のリアルタイムモニタリングを可能にします。 100nMのボンベシン（BBS）及び30 mMの塩化カリウム（KClの）の両方が知られているG qの指標細胞内カルシウムの一過性増加を刺激しました&lt;/サブ&gt; -一次L細胞（ 図2D）における起電結合経路。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> 図2：一次小腸培養物に由来する代表的なデータ。 （A）分泌および（B）イメージング実験のために使用される混合プライマリ小腸培養物の例画像は24時間めっきを投稿します。 （A）画像は、4X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて、24ウェルプレートから採取しました。スケールバー= 500μmで。 GLU-Creを使用（B）は ROSA26 GCamP3マウスをX、視野内のL細胞（緑色細胞）GCaMP3の蛍光により同定しました。スケールバーは50μmで表しています。 （C）GLP-1分泌は（BBS、100 nm）を、フォルスコリン/ 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）（F / I、10μMずつ）をボンベシンに応答して測定されました。パーセンテージGLP-1分泌を算出しました上清および細胞溶解物中のGLP-1レベルを測定することによって。データは、各条件についてN = 3の平均±SEMを表します。 （D）（B）に概説2つのセルのGCaMP3蛍光（細胞質カルシウムを反映する）は、塩化カリウム（KClを、30mMの）とBBS（100nMで）に応答してリアルタイムで監視します。単一細胞イメージングは​​、40X油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて行きました。 GCaMP3 75 Wキセノンアークランプ、蛍光イメージングソフトウェアによって制御されるモノクロメーターを使用して、10分の475のnmで励起しました。発光は、ダイクロイックミラーと、510から560 nmの帯域フィルタを用いた高解像度デジタル電荷結合素子（CCD）カメラで記録しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養を記載しています。これらの一次腸の培養物は、多くの技術を使用して、腸ペプチド分泌の根底にあるシグナル伝達経路の研究を可能にします。

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

本手法の全般的な目的は、混合マウス腸管細胞を単離・培養し、腸管ペプチド分泌の研究および腸内分泌細胞の生細胞イメージングを可能にすることです。我々は元々、腸内分泌細胞のin vitroにおける特性評価を可能にするために本手法を開発しました。腸内分泌細胞は腸管内容物を監視し、身体の恒常性を調節しています。しかし、これらは腸上皮全体に分散しているため、研究が困難でした。ここで述べるカルシウムイメージング（calcis）は、腸内分泌細胞の遺伝学的蛍光タグ付けと組み合わせることで特に有用となり、単一細胞電気生理学および生細胞イメージング技術の使用が可能になります。本手順の実演は、当研究室のポストドクであるCheryl Brightonが行います。まず、単離したマウス十二指腸をPBSを満たした10 cmのシャーレに移します。ピンセットで腸管断片の一端を慎重に固定し、パステールピペットの先端を管腔内に挿入します。その後、冷却したPBSで腸管内容物を洗い流します。内容物の大部分が除去されるまで、腸の両端でこの操作を繰り返します。洗浄した腸を、新鮮で冷却されたPBSを満たした清潔なペトリ皿に移します。解剖顕微鏡下で、筋層が剥がれないように注意しながら、腸断片から脂肪組織および腸間膜を除去します。次に、組織の近位端にある筋肉層のフラップを特定します。その後、2組の微細ピンセットを用いて、腸の周囲全体にわたって筋肉層を少量ずつ慎重に引き離します。腸と可能な限りの筋肉フラップを掴み、層をゆっくりと引き離しながら、腸の周囲から筋肉層を剥がし始めます。筋層と上皮が裂けるのを防ぐため、ピンセットを密着させた状態で保持します。腸管断片の全長にわたって筋層を除去します。その後、腸管を縦方向に切開して開き、新鮮で冷やしたPBSを入れた清潔なペトリ皿に移します。組織を攪拌し、残っている食糜や粘液を洗い流します。洗浄後、外科用メスを用いて組織を切り、約1〜2平方ミリメートルの正方形に切り出します。次に、あらかじめ濡らして先端を切断したパステールピペットを使用し、切り出した断片を、約20 mLの冷却PBSを満たした50 mL遠心チューブに移します。チューブを静かに振って組織片をさらに洗浄し、組織を沈殿させます。組織が沈殿したら、PBSの大部分を吸引し、新鮮なPBSでサンプルをもう一度洗浄します。腸を消化させるため、10 mL セロロジカルピペットを使用して組織片を、冷却した滅菌 DMEM が入った滅菌 50 mL 遠心チューブに移し、懸濁液を回転させて組織を沈殿させた後、培地を除去します。組織片に消化培地を7 milliliters加え、懸濁液を撹拌します。この懸濁液を37 °Cのウォーターバスで5分間インキュベートします。インキュベート後、チューブを約3秒間、穏やかに振盪します。未消化組織を沈殿させ、消化培地を15 milliliter遠心チューブに移します。誤って回収された組織がある場合は、それが沈殿するまで待ち、10 milliliterセロロジカルピペットを使用して、未消化組織が入った15 milliliter遠心チューブに戻します。顕微鏡観察用に少量の消化培地を保存し、残りは廃棄します。光学顕微鏡下で消化培地の中身を観察し、懸濁液中に多くの陰窩が含まれていないことを確認します。次に、7 millilitersの新鮮な消化培地を加え、消化手順をもう一度行います。陰窩断片懸濁液を調製するには、腸管断片に7 millilitersの新鮮な消化培地を加えます。組織を37 °Cの水槽で10分間インキュベートします。今回は、5分ごとに、より長く、より激しくサンプルを振とうします。未消化の組織を沈殿させ、消化培地を15 mL遠心チューブに移します。誤って回収された組織を沈降させ、10 mLのセロロジカルピペットを使用して、未消化組織が入った50 mL遠心チューブに戻します。腸管断片に7 mLの新鮮な消化培地を加え、次の消化を開始します。その後、前回の消化で回収した培地を、室温、100 x gで3分間遠心分離します。上清を捨てた後、あらかじめ温めておいた5 millilitersの培養液を加え、緩やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。その後、サンプルを置いておき、細胞懸濁液の一部を少量分注して採取します。光学顕微鏡下で、サンプルに単離されたクリプト断片が含まれていることを確認してください。組織の大部分が消化されるまで、組織の消化をさらに2〜3回繰り返します。消化上清を回収したら、それらすべてを合わせ、室温で100x gにて3分間、サンプルを遠心分離します。上清を捨て、アノイキスを防止する10 micromolarのY-27632を添加し、あらかじめ温めておいた5 millilitersの培地を用いて、塊が見えなくなるまで緩やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。最後に、細胞懸濁液を100 micronフィルターでろ過し、未消化の組織を除去します。Y-27632を添加し、あらかじめ温めておいた培養液をさらに2 milliliters加えてフィルターを洗浄します。細胞を播種する前に、基底膜マトリックスでコーティングしたプレートをインキュベーターから取り出します。プレートから過剰な基底膜マトリックス溶液を除去し、10 µMのY-27632を添加して予熱した培地を各ウェルに250 µLずつ加えます。細胞懸濁液250 µLを、ゆっくりとジグザグに動かしながら滴下するように24ウェルプレートの各ウェルに播種します。プレートを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。ここに、培養から18〜24時間後に撮影した初代小腸細胞単層の顕微鏡画像を示します。in vitroで培養された初代小腸細胞は、細胞内カルシウムまたはサイクリックAMPを上昇させる刺激に反応し、ボンベシンで処理した場合にはグルカゴン様ペプチド-1の放出が2倍に増加し、フォルスコリンとIBMXで同時に刺激した場合には分泌が11倍に促進されました。最後に、プログルカゴンプロモーターの制御下でGCAMP 3を発現するトランスジェニックマウスから作製した培養細胞を用いて、蛍光強度の増強により、初代小腸L細胞がボンベシンおよび塩化カリウム刺激に反応して細胞質カルシウムが増加することが示されました。本手順では、多くの研究者が困難だと感じている培養小腸細胞に焦点を当てています。また、同様の手法を用いて、マウスおよびヒト由来の他の腸管セグメントの培養も行っています。この技術を習得し、適切に実施すれば、4時間で完了させることができます。調製の結果は毎回異なるため、各消化液の分注検体を顕微鏡下で確認することが重要です。これにより、進行状況を評価し、振盪の強度や消化回数を適切に調整することが可能になります。

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