腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

この手順の全体的な目標は、浸潤や播種などの腫瘍細胞の挙動の長期的な評価を可能にし、免疫能力のある動物宿主で潜在的な治療法をテストすることです。この方法は、薬物反応の持続性や浸潤と拡散を促進するメカニズムなど、小児脳腫瘍の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、宿主への毒性を最小限に抑えることで、腫瘍細胞の持続的な生着を可能にし、したがって脳腫瘍生物学の長期的な研究を可能にすることです。

この技術の意味は、薬物治療後に腫瘍量をin vivoで直接評価できるため、脳腫瘍の治療にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな人は、腫瘍細胞懸濁液が濃度が高すぎたり、希薄すぎたりすると苦労し、第4脳室に一貫した量を注入することが困難になります。まず、卵水に溶解した1.2%アガロースの50ミリリットル溶液を準備します。

アガロースが溶解するまで溶液を沸騰させ、次に1リットルあたり05ミリグラムのメチレンブルーを加えて補います。最終溶液の25ミリリットルを10センチメートルのシャーレに注ぎ、固化させます。残りの25ミリリットルのアガロース溶液を摂氏42度の水浴に入れます。

次に、固化した表面の中央に直径2インチのビーカーをセットし、残りの25ミリリットルの1.2%アガロースを前の層に注ぎます。注入プレートは、注入前に少なくとも30分間摂氏28度に維持するか、長期保存の場合は摂氏4度に維持します。ニードルプラーを使用して、外形寸法が1.2ミリメートル、内寸が0.9ミリメートルの10センチの毛細血管を引っ張って針を作ります。

プラスチックパラフィンフィルムで包まれた顕微鏡スライドに針を慎重に置きます。次に、かみそりの刃を使用して針の端を45度の角度で切断し、先端に開口部のある針を作成します。脳腫瘍担持魚を安楽死させ、テキストプロトコルに従って腫瘍を解剖した後、P1000を手動で使用して、均一で曇った溶液が開発されるまで腫瘍塊を混乱させます。

ピペットまたは40ミクロンのセルストレーナーを使用して、大きな微粒子を除去します。次に、懸濁液を室温で290倍gで5分間遠心分離し、上清を除去します。腫瘍細胞ペレットを100マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

250マイクロリットルのPBSを使用して、細胞懸濁液の5マイクロリットルを希釈します。次に、血球計算盤を使用して細胞の数をカウントします。懸濁液を290倍gで3分間遠心分離します。

上清を除去した後、滅菌PBSを使用してペレットを再懸濁し、目的の細胞濃度を得ます。移植処置中は、腫瘍懸濁液を摂氏28度のヒートブロックに保管します。トランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた10〜20個の胚を注入プレートの周辺に移します。

胚は横方向に落下し、心室がはっきりと見えてアクセス可能である必要があります。角度付きプローブを使用して、必要に応じて胚を調整し、注入プレートの外縁から離して配置します。次に、ゲルローディングチップを使用して、腫瘍細胞懸濁液の1〜2マイクロリットルを注射針にロードし、針をマニピュレーターに挿入します。

次に、マニピュレーターを手動で下げ、針を45度の角度で保持します。マイクロマニピュレーターのノブをx、y、z方向に調整し、針が胚の頭のすぐ上、約5mm右に来るようにします。実体顕微鏡を使用して、針が胚の第4脳室を貫通するまで、マイクロマニピュレーターをx方向にゆっくりと調整します。

針が心臓や卵黄を突き刺さないようにしてください。一貫した注射のためには、胚に麻酔をかけ、腫瘍を細胞懸濁液に適切に解離させ、針は第4脳室を貫通しなければならないが、心臓を超えて伸びてはならない。マイクロインジェクターフットペダルを押して、腫瘍細胞懸濁液を注入します。

注入が終了したら、新鮮な卵水を使用して、注入した胚を注入プレートからシャーレにやさしく洗い流します。次に、注入された胚を暗い部屋の蛍光実体顕微鏡で検査します。注入圧力、角度、針のサイズ、および細胞懸濁液の粘度により、腫瘍細胞が心室空間の25〜50%を占めることを確認します。

胚を摂氏28度のインキュベーターに一晩戻します。翌日、前述のように、正常な心臓や脳の発達などの形態学的および生理学的特徴を調べることにより、胚の生存を評価します。トランスファーピペットを使用して、ペトリ皿の中央に4%メチルセルロースを追加し、麻酔した胚をメチルセルロース滴に追加します。

角度付きプローブを使用して胚の向きを合わせ、蛍光顕微鏡で一貫した生着サイズをスクリーニングします。腫瘍の維持のためには、受精後8日経過したら、移植した胚をタンクに入れて成長させます。画像化し、テキストプロトコルに従って追加の研究を実施します。

この実験では、メラノフォアを欠くミトファゼブラフィッシュ変異体に中枢神経系原始神経外胚葉腫瘍細胞を移植しました。移植後24時間という早い時期に、腫瘍細胞が周囲の脳組織に侵入しているのが見られます。腫瘍移植片は、来週にわたって心室と周囲の脳組織で増殖し続け、腎臓の領域でも蛍光が観察されます。

腫瘍細胞は増殖と浸潤を続けるため、受精後28日でゼブラフィッシュの脳全体に腫瘍塊が見られます。mCherry標識脳腫瘍細胞を移植したゼブラフィッシュの代表群をこの図に示します。腫瘍細胞の生着は通常、ゼブラフィッシュの80〜90%で達成され、腫瘍移植は成体期まで持続します。

この実験では、視蓋からのNRAS駆動mCherry標識ゼブラフィッシュCNS-PNETと小脳からのGFP標識CNS-PNETを全腫瘍解離によって採取し、シングルセル懸濁液に加工した後、移植前に1対1の比率で混合しました。移植の4日後に想像されたこの代表的な胚は、赤の視蓋腫瘍細胞が小脳腫瘍よりも宿主脳に広範囲に移動することを示しています。習得すると、約300個の胚を3〜4時間で注入できます。

この手順に続いて、腫瘍細胞の生物学、薬物反応、および化学療法抵抗性に関連する追加の質問に答えるために、生きた動物のイメージングや薬物投与などの追加の方法を実行できます。この技術の開発後、この技術は、ゼブラフィッシュがんモデリング分野の研究者が小児脳腫瘍を治療するための新しい阻害剤を探求する道を開きました。