Name: 腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ胚への脳腫瘍細胞移植法。免疫適格宿主で腫瘍の浸潤・薬物応答を長期的に評価し、小児脳がん治療戦略の開発に貢献します。

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2人の批評家に原稿の優れた提案と改善を感謝します。ユタ大学ハンツマン・ガン研究所（Huntsman Cancer Institute / University of Utah）にも、動物飼育と維持管理に感謝します。この研究は、米国癌協会（＃124250-RSG-13-025-01-CSM）、NIH助成金（P30 CA042014 CRRプログラム）、ユタシードグラント大学、ハンツマン癌基金の資金提供を受けました。

全ての動物手順は、ユタ大学機関動物管理および使用委員会（IACUC＃16-03019）の動物保護ガイドラインに従って承認され、それに従った。 1.マイクロインジェクションのための装置の準備<ol><li> 注入プレートの準備。 <ol><li>卵水に溶解した1.2％アガロース（逆浸透水中の0.6g / Lアクアリウム塩+ 0.01mg / Lメチレンブルー）の50mL溶液を調製する。アガロースが溶解するまで溶液を沸騰させ、0.05mg / Lのメチレンブルーを添加して補充する。最終溶液25 mLを10 cmペトリ皿に注ぎ、固化させます。ステップ1.1.2の準備が整うまで、42℃の水浴中に残りの25mLのアガロース溶液を入れる。 </li><li>固化した表面の中心に直径2インチのビーカーをセットし、残りの25mLの1.2％アガロースを注ぎます。 注：これにより、プレートの周囲に注入面が形成され、中心にコアが形成されます。針サイズおよび腫瘍懸濁液の一貫性を試験するための領域を提供する。 <ol><li>注射プレートを注射前に少なくとも30分間28℃で、または長期保存のために4℃で維持する。 </li></ol></li></ol></li><li> 注射針を準備する。 <ol><li>ニードルは、ニードルプラー上の2本のニードルに外径1.2mm、内寸0.9mm（フィラメントなし）の10cmキャピラリーを引っ張って作成します。 注：各針は、全長が6cmで、端部の約1.5cmが先細になっています。 </li><li>慎重にプラスチックパラフィンフィルムで包まれた顕微鏡スライド上に針を置きます。かみそりの刃を使って45°の角度で針の端を切断し、先端に開口部​​を有する針を作成する。 注：通常、針の端から0.1 mm〜0.3 mmは取り外されます。傾斜した先端は、注射を行うために必要とされない。 </li></ol></li><li>マイクロインジェクションのセットアップを準備します。 <ol> &lt;li&gt;移植のための実体顕微鏡、マニピュレータ、マイクロインジェクタなどの標準的なマイクロインジェクションの設定を行います。 </li></ol></li></ol> 2.移植のための胚の準備<ol><li>記載されているように最大500のmitfa w2胚44 （または使用者が定義した他のゼブラフィッシュ遺伝子型の胚）を収集し、28℃のインキュベーターで維持する。 </li><li>卵水で希釈した10mg / mLのプロテアーゼカクテル溶液100μLを添加し、約20分間穏やかに揺することにより、24hpfで胚を脱皮する。新鮮な卵の水で胚を3回すすいで残留プロテアーゼを除去する。 </li><li>適切な発達段階のために48 hpfで胚をスクリーニングする。これは標準的なステージング系列の基準45で定義される。 注：移植のためには、正確に段階化され形態学的に正常な胚のみを使用すべきである。 </li><li>麻酔するペトリ皿中に0.002％のTricaine-Sを含有する卵の水中に約48hpfの胚を移植した。動きの停止を観察して適切な麻酔を確認する。 </li></ol> 3.腫瘍細胞懸濁液を作る注：ゼブラフィッシュ脳腫瘍モデルは、腫瘍遺伝子と腫瘍サプレッサー遺伝子の組み合わせを遺伝子操作することによって生成することができる17,46,47。ここで、 最近記載されたように、 sox10プロモーター駆動NRAS WT 、 p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNETゼブラフィッシュモデルを使用した。 <ol><li> 0.4％トリカイン-Sの過剰摂取を用いてIACUC承認プロトコールに従って氷水に浸漬し、全身サイズの約20％の腫瘍を有する脳腫瘍魚を安楽死させる。 </li><li>蛍光標識した腫瘍をカミソリの刃でピンセットで切り取り、ピンセットを蛍光下で顕微鏡で滅菌技術を用いて洗浄し、5mLの1×リン酸緩衝食塩水（PBS）に入れる。 注：正確な解剖方法は、ユーザ定義であり、腫瘍の種類および組織の位置に依存する。異なるゼブラフィッシュの器官および脳腫瘍の解剖の詳細な手順については、リストされている参考文献を参照してください17,48。 </li><li>均一な濁った溶液が発生するまで、p1000ピペットを用いて腫瘍の質量を手動で破壊する。ピペットチップまたは40μmの細胞ストレーナーを使用して大きな微粒子を除去する（これは腫瘍に依存する）。懸濁液を室温で5分間、290×gで遠心分離し、上清を除去する。 注：蛍光活性化細胞選別（FACS）は、腫瘍細胞を単離するために実施されない。これにより、間質細胞、免疫細胞および腫瘍細胞の異種集団の移植が可能になる。 </li><li>腫瘍細胞ペレットを100μLの滅菌PBSに再懸濁し、1.5mLマイクロ遠心チューブ。 5μLの細胞懸濁液を取り、250μLのPBSで希釈する。血球計数器を用いて細胞の数を数える。懸濁液を290xgで3分間遠心分離し、上清を除去し、所望の細胞濃度を得るためにペレットを滅菌PBSに再懸濁する。 注：通常、30〜40μLの滅菌PBSに再懸濁した細胞は、粘性が高く不透明な溶液（細胞濃度≧100 cells / nL）を生成し、最も成功した移植を生成する傾向があります。細胞生存率は評価されない。 </li><li>移植手順中に腫瘍懸濁液を28℃のヒートブロック上に保存する。 </li></ol> 4. 2 dpf胚の第4の心室への腫瘍懸濁液の注入<ol><li>移送ピペットを用いて10-20の麻酔した胚（ステップ2.4から）を注射プレートの周辺に移す。胚は、インプラントプレート上に横方向に落ち、心室がはっきりと見え、アクセス可能でなければならない。角度のついたプローブを使用して、必要に応じて胚を調整し、胚を注射プレートの外縁から離します。 </li><li>ゲル充填ピペットチップを使用して、腫瘍細胞懸濁液1〜2μLを注射針に充填し、マニピュレーターに注射針を挿入する。 </li><li> ニードルを45°の角度にしてマニピュレータを手動で下げます。マイクロマニピュレーター上のノブをx、y、z方向に調整して、針が胚の頭のすぐ上で約5 mmになるようにします。実体顕微鏡の接眼レンズを見て、針が第4脳室を穿孔するまでマイクロマニピュレーターをx方向にゆっくりと調整します。針が心臓や卵黄を突き刺さないようにしてください。 <ol><li>腫瘍細胞懸濁液を注入するために、マイクロインジェクタに取り付けられたフットペダルを押す。 注記：射出圧力と時間はニードルの穴径によって異なりますが、開始点は5〜10 PSIと50〜100 msです。注入された腫瘍細胞の体積は、必要に応じて、鉱油への注射による標準的な油滴技術を用いて評価することができる。典型的には、0.1mmの液滴直径を有する500μLの注射が最良の結果を与える。 </li></ol></li><li>注入プレートから注入した胚を、新鮮な卵の水を用いてゆっくりとすすいだ。残りの手順のために、またはそれらがタンクで増殖するまで、胚の水を卵の水に入れて維持する（ステップ4.9.1に記載）。 </li><li>注入された胚を蛍光実体顕微鏡下で検査する。注射圧力、角度、針の大きさ、および細胞の懸濁粘度が、腫瘍細胞が心室の空間の25〜50％を満たすことを確認する。必要に応じてこれらのパラメータを調整します。 </li><li>残りの胚について、ステップ4.1〜4.5を繰り返す。必要に応じて追加の胚を麻酔する（2.4項を参照）。 注：経験豊富なユーザーは、3〜4時間にわたって最大300個の胚を注入することができます。 </li><li>胚を戻す28℃のインキュベーターを一晩インキュベートする。 </li><li> 翌日、記載されているように、正常な心臓および脳の発達などの形態学的および生理学的特徴を調べることによって胚生存を評価する。 </li><li>スクリーニングのために、移植後1日目（dpt）に、ステップ2.4に記載のように胚を麻酔する。 <ol><li>ペトリ皿の中央に4％メチルセルロースを添加し、メチルセルロース滴に胚を加えるために移送ピペットを使用してください。蛍光顕微鏡を使用して一貫した生着サイズのために、角度のついたプローブおよびスクリーニングを用いて胚（光源に面する腹側）を向ける。心室に限定されない腫瘍細胞を有する胚、または心室の空間の25％未満を含む腫瘍細胞を含む胚を除去する。 注：一貫した生着は、心室スペース17の 25〜50％を包含する単一の腫瘍塊を有する胚として定義される。スクリーニング目的のために、蛍光s1X対物レンズ、0.15開口数、0.7〜1.6Xの倍率、50ms〜1秒の露光時間を有する顕微鏡顕微鏡である。すべての画像で、GFPまたはRFPチャンネルの他に明視野チャンネルを使用します。 </li><li>腫瘍の維持のために、移植された胚を8 dpf（6 dpt）で45倍になるようにタンクに入れる。 </li></ol></li></ol> 5.細胞挙動のためのイメージング移植胚<ol><li> 1.2％低融点アガロース中で3〜8dpf（1-6dpt）で胚を麻酔し、マウントする（背側はカバースリップに面する）。必要に応じて、移動、細胞分裂、または細胞 - 細胞相互作用などの細胞の挙動を視覚化するために、所望の長さのレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて、マウントされた胚の時間経過イメージングを行う38,43,53。 注：アスペクト比1,024 x 1,024、スキャン速度8＆181; s /ピクセル。スキャンの平均化を行い、全深部（1,000-1,500μm）の捕捉を確実にするためにz深度の寸法を定義する。さらに、40倍の対物レンズを使用して10〜15分ごとに画像を取得し、侵襲的な行動を監視する4時間のタイムラプス実験を行います。検出器の感度は腫瘍の質量に依存して変化し、レーザー出力は顕微鏡に依存するが、一般的には15〜40％であることが推奨される。 </li><li>イメージングが完了したら、角度のついたプローブを用いてアガロースからマウントされた胚を解放し、新鮮な卵の水でペトリ皿に移す。 </li></ol>移植胚への薬剤投与および腫瘍量の評価17 <ol><li>胚を3 dpfで麻酔し、腹側を光源に向けて4％メチルセルロース中でそれらを向ける。蛍光顕微鏡17を用いて前処理胚を画像化する。 </li><li>プラ移植した胚を12穴プレートに3 dpfで入れ、0.5 mlの卵水に1ウェルあたり10匹の胚を入れる。適切な量​​の薬物を加えて所望の最終濃度（ 例えば、 50μMのMEK阻害剤）を得、胚を28℃のインキュベーターに戻す。翌日、薄い穴の移送ピペットで薬剤で処理した卵の水を取り除き、新しい処置を加えます。胚が8 dpfに達するまでこれを毎日繰り返す。 </li><li> 8dpfで、胚を薬物処理から取り出し、それらを新鮮な卵の水に入れる。胚を麻酔し、4％メチルセルロース（光源に面する腹側）を麻酔する。蛍光顕微鏡を用いた画像胚後処理。記載されているように、適切なソフトウェアを使用して腫瘍領域を定量する。 </li><li>処理ごとに適切な胚を分離し、成長させるためにそれらをタンクに入れる。 4〜9週間後、魚を麻酔し、標準的な蛍光実体顕微鏡を用いてdエスケープ17 。 </li></ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、完全にコンピテントな免疫系を発達させる2-dpf胚の心室にゼブラフィッシュ腫瘍細胞を注入することを含む、単純かつ効率的な移植アッセイを詳述する。これまでのところ、ゼブラフィッシュCNS-PNET17および黒色腫（データは示さず）は、腫瘍細胞の挙動および浸潤の長期研究のために首尾よく移植されている。このプロトコルの重要なステップには、適切な針の穴の大きさと適切な腫瘍細胞懸濁液の確保と適切な麻酔の宿主胚の確保が含まれます。個々の研究者ごとに、この技術のさらなる最適化には、腫瘍細胞濃度、注入圧力、および胚の配向の調整が含まれ得る。さらに、異なる腫瘍に由来する懸濁液の粘度には不均質性が存在する可能性があるので、異なる腫瘍型は、再懸濁および移植が多少難しくなる可能性がある。ただし、ニードルの穴径を調整してdiffe腫瘍懸濁液の希釈液を希釈することにより、腫瘍の粘性に関連する困難を克服することが可能である。 我々の経験では、心室の疎細胞/不一致細胞塊の最も一般的な理由は以下の通りである：1）腫瘍細胞懸濁液が希薄である。 2）針の口径が小さすぎる。 3）噴射時間と圧力が低すぎる。および/または4）残りの組織は、腫瘍から濾過されず、針内に留置された。腫瘍細胞懸濁液が注射後に心室から流出するとき、それは、1）心室の床に対する針の配置; 2）高い射出圧力および時間;および/または3）針の孔径が大きすぎる。移植された胚の低い生存は、1）長期間胚を麻酔すること; 2）注射プレート上に胚を残して乾燥させる。 3）気泡の心室への注入;および/または4）脳などの重要な臓器を突き刺すこと、および針は心室を通過したので、心臓。 成体または胚性ゼブラフィッシュ脳における腫瘍移植の従来の方法は、成人（遺伝的に、薬理学的に、または放射線を介して ）の免疫抑制に依存するか、または胚38,43,52,53,54におけるヒトまたはマウス細胞の短期間の研究に限定されている 。例えば、マウス脳腫瘍は、短期間（約2日間）の前臨床薬物アッセイで使用するために、デキサメタゾン免疫抑制30-dpf、若年ゼブラフィッシュに鼻腔内注射することができる54 。しかし、これらの実験における注射部位は、頭蓋および脳組織によって覆い隠され、正常な脳組織への損傷をもたらし、宿主の生存率および生着効率を低下させる可能性がある。別の最近記載された方法は、ヒトの膠葉の注射ラストーマ細胞株をゼブラフィッシュ胚の中脳領域に導入し、成長、浸潤および薬物応答の短期分析を可能にした43 。再度、注射部位の正確な位置は可変であり、正常組織に損傷を与える可能性がある。従って、胚性脳移植の従来の方法は、宿主の生存能力を損なうことが多く、これらの研究を短期間の分析（ すなわち、 2〜14日）に制限し、不明瞭な注射部位による個々の注射間の可変性の増加をもたらし、複数の世代にわたる細胞挙動および薬物反応または再移植の長期的な分析が含まれる。 ここに記載されている方法は、ゼブラフィッシュの胚性および免疫不全移植技術における現在の限界に対処するもので、研究者は、1）周辺組織への損傷を最小限に抑えながら同じ場所に再現性よく注射することができる。 2）注射部位を直接可視化して最大化する生着効率; 3）1日に何百もの胚を移植する。 4）免疫賦活動物において腫瘍が増殖することを可能にする; 5）ゼブラフィッシュの寿命にわたって腫瘍細胞の挙動および耐性薬物応答のモニタリングを可能にする; 6）腫瘍の進化または薬物再発のメカニズムに関する潜在的な研究のために、多くの世代にわたって腫瘍の再移植が可能である。さらに、このプロトコルにより、研究者は異なる免疫集団を含む宿主応答の評価に任意のゼブラフィッシュ遺伝子型を利用することが可能になる。これらの特性により、この方法はすでにゼブラフィッシュで標準的なマイクロインジェクションを行っているラボで容易に適用できます。最後に、この方法は、ゼブラフィッシュ脳腫瘍の同所注射に理想的であるが、肝臓または膵臓などの他の腫瘍型を移植する場合、同位体部位は免疫能力より重要であり得る（ 例えば、研究者が間質腫瘍増殖に関する微小環境）。このシナリオでは、新しく開発された免疫不全ゼブラフィッシュモデルは、同所性腫瘍移植を行うために、より適切かもしれない11 。 このプロトコルは、腫瘍細胞の競合アッセイを実施し、二重標識腫瘍を注入するために使用されている。水への薬剤の添加による移植後の胚の治療を含む、腫瘍形成に対する化学化合物の有効性の評価のための潜在的な治療戦略も議論された。移植前の腫瘍細胞のエクスビボ治療のための方法も以前に報告されている17 。さらに、移植された腫瘍は、複数回の再移植のためにプールされており、腫瘍進化および化学療法抵抗性の研究に有益であろう17 。現在、前臨床試験は、潜在的な化合物の有効性を評価するためのマウス異種移植片に依存している。しかし、これらの研究は時間がかかるコストがかかる。ゼブラフィッシュとヒトの間の発がん性シグナル伝達経路の高度の保存を考慮すると、この方法は従来のマウスおよびヒトの細胞研究を補完して、前臨床および臨床試験に入る有効化合物のより迅速な同定を可能にする。結局のところ、この方法は、プライマリ患者の腫瘍の迅速な化学的スクリーニングに有用であることが判明する可能性があり、パーソナライズド・メディス・イニシアチブをさらに推進する可能性がある。しかしながら、ゼブラフィッシュ（成体または胚）におけるヒト細胞の長期間の増殖のための条件を同定する必要がある。

免疫不全動物、特にマウス異種移植片への腫瘍細胞の移植は、癌細胞増殖1,2 、生存、浸潤および転移を制御するメカニズムを研究するために広く使用されている技術であり、同様にプラットフォームを提供するスクリーニング用薬物5,6,7 。より最近では、原発性腫瘍サンプルの免疫不全マウスへの移植は、診断および前臨床薬物スクリーニング目的のための患者由来異種移植（PDX）モデルを生成するために使用されており、パーソナライズド医薬品イニシアチブのバックボーンである8,9,10,11 。しかし、重要な証拠は、免疫系の調節幹は、腫瘍の行動および患者の転帰に劇的な影響を及ぼす可能性がある12,13 。これは、ヒト免疫細胞を腫瘍細胞と同時移植することによってマウスの免疫系が再構成される「ヒト化」マウスを含む異種移植に基づく技術の再設計を促した。しかしながら、このアプローチは技術的に困難であり、その技術に関連した変動する再現性および毒性があり、重要なコスト14,15に加えています。従って、免疫賦活動物における新しい移植技術は、癌進行および薬物応答の免疫および腫瘍特異的メカニズムの発見を加速するために必要とされる。 ゼブラフィッシュは、ヒトがんの研究のための代替動物モデルであり、現在20以上のがんモデルが確立されており、 16例には、悪性度の高い脳17 、メラ<html> noma 18,19,20 、および膵臓癌21,22ならびに多くの白血病23,24,25,26,27が挙げられる。ゼブラフィッシュシステムの2つの特質は、癌研究に特に適している：1）半透明動物の光学的透明性は、単純な顕微鏡技術を用いた癌細胞の挙動（ すなわち、増殖、生存、浸潤および播種）女性のゼブラフィッシュは、低コストで遺伝子スクリーニングまたは薬物スクリーニングのための動物数の迅速なスケーリングを可能にし、1日あたり200個の胚を産生することができる。さらに、ゼブラフィッシュおよびヒトの癌ゲノムは、高度に保存されている（癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を含む）これらの特性はまた、ゼブラフィッシュを移植技術の理想的な動物モデルとし、システムのイメージング、スケーラビリティ、および低コストを利用します。 免疫不全ゼブラフィッシュにおける以前の腫瘍移植研究は、自己再生能、腫瘍悪性腫瘍、および浸潤/播種の同定を容易にした11,29。腫瘍細胞挙動の短期間の研究は、γ線を照射した成人への移植後に行うことができ、その免疫系は〜20日間効果的に抑制される11,30。成人ゼブラフィッシュのデキサメタゾンによる治療は、拒絶反応が起こるまでに30日までB細胞およびT細胞を抑制する31 。別のあまり一般的でない戦略は、クローンゼブラフィッシュ株免疫能を有する宿主における長期的な調査を可能にする。しかしながら、限られた数のクローン株しか生成されず、産卵数が少ないために維持することが困難である。さらに、確立されたゼブラフィッシュ腫瘍モデルのほとんどは、他の遺伝的背景において生成されるので、免疫系を抑制することなくこれらの腫瘍をクローン株に移植することはできない11,33,34。長期移植研究を改善するためのより最近のアプローチには、複数の癌35,36の移植に成功したB細胞機能およびT細胞機能の障害を有するrag2 E450fs突然変異株の開発が含まれる。クローンゼブラフィッシュ系統または免疫不全宿主の必要性を回避するために、多数のグループが早期段階の胚を使用している（ すなわち、 &gt; 72馬力これらの胚はまだ適応免疫系を完全に発達させていない37,38,39,40,41,42,43のヒト腫瘍細胞移植のための胚性幹細胞移植（ost-fertilization（hpf））がある。しかしながら、これらの方法は、ヒト癌細胞または移植技術自体が宿主を殺し、長期間の研究および再移植を妨げるため、腫瘍細胞の挙動または薬物応答（通常は2週間未満）の短期分析に限定される。 このプロトコールは、受精後2日（dpf）胚の脳の第4脳室の内腔への修正された胚移植法を詳述している。それは宿主に対する毒性を最小限に抑え、腫瘍細胞の長期生着のためにゼブラフィッシュ脳腫瘍モデルと組み合わせることができます。従って、この技術は、腫瘍の異種性、宿主/免疫応答、薬物応答、または転移能についての将来の研究を容易にし、腫瘍細胞の新しい世代への再移植のための最低限度を提供する。この方法は、最大90％の生着を伴い、1日に1人のユーザーが最大300回の移植を行うことができるため、シンプルで効率的でスケーラブルです。これにより、遺伝子または薬物スクリーニングプロジェクトのために、単一の原発腫瘍を2 dpfの数百の胚に迅速に増殖させることが可能になり、または数ヶ月にわたって様々な宿主背景で脳腫瘍細胞の行動を直接視覚化することが可能になる。

<table><tbody><tr><td>胚を飼育するハウス</td><td></td>内の<td>卵水</td><td>、注入プレートを作る&nbsp;</td></tr><tr><td>メチレンブルー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td>は<td>、真菌の増殖を防ぐために卵水に加え</td></tr>ます <tr><td>シャーレ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FB0875711Z&nbsp;</td><td>胚の収容、注入プレートの作製</td></tr><tr><td>50 mL&nbsp;ビーカー(直径2インチ)</td><td>注射プレートを作る</td><td>商業ブランド</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>デンビル</td><td>CA3510-8</td><td>注射板を作る</td></tr><tr><td>ガラス容器</td><td>注射板を作る</td><td>商業ブランド</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-10</td><td>腫瘍解剖</td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー12640</td><td>針の準備、腫瘍の解剖</td></tr><tr><td>パラフィルムで包まれたスライド</td>ガラス 市販<td>ブランドの</td><td></td><td>針の準備</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 1x、pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>腫瘍再懸濁</td></tr>液 <tr><td>細胞ストレーナー、40 & マイクロ;m</td><td>Corning Falcon</td><td>352340</td>腫瘍<td>再懸濁</td></tr><tr><td>1,000 &micro;Lフィルターチップ</td><td>任意の商用ブランドの</td><td></td><td>腫瘍再懸濁液</td></tr><tr><td>100&micro;Lフィルターチップ</td><td>任意の商用ブランドの</td><td></td><td>腫瘍再懸濁</td></tr><tr><td>液50mLコニカルチューブGenesee</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>21-108</td><td>腫瘍再懸濁液</td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブGenesee</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>21-103&nbsp;</td><td>腫瘍の再懸濁</td></tr><tr><td>1.7 mLマイクロチューブ</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-281</td><td>腫瘍再懸濁</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>市販ブランドの</td><td></td><td>腫瘍再懸濁および移植</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー(フィラメントなし)</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp;TW120-4</td><td>腫瘍移植</td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>P-97</td><td>腫瘍移植</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td>腫瘍移植</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>ハーバード装置</td><td>PLI-90</td><td>腫瘍移植</td></tr><tr><td>トリカイン-S (MS-222)</td><td>ウエスタンケミカル</td><td>TRS1</td><td>腫瘍移植、麻酔薬</td></tr><tr><td>角度付きプローブ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10140-02</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>任意の商用ブランドの</td><td></td><td>胚操作</td></tr><tr><td>遠心分離機</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>5810R</td><td>腫瘍再懸濁中</td></tr><tr>に必要な<td>微量遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424</td><td>腫瘍再懸濁中</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>SZ61</td><td>腫瘍移植</td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td>イメージング腫瘍移植顕微鏡</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>オリンパス</td><td>DP-72</td><td>イメージング腫瘍移植</td></tr><tr><td>メチルセルロース&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M7140</td><td>イメージング腫瘍移植</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>胚を維持し、注入プレートを温める</td>商業<td>ブランド</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>注射プレートを作る</td><td>商業ブランド</td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>注射プレートを作る</td><td>商業ブランド</td><td></td></tr><tr><td>グローブ</td><td>プロトコル</td>のすべての商業ブランド<td></td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td> 商業<td>ブランドの</td><td></td><td>胚の共焦点イメージング</td></tr><tr><td>ガラスボトムディッシュ</td><td>Mattek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td>胚の共焦点イメージング</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FLUOVIEW FV1200</td><td>胚の共焦点イメージング</td></tr><tr><td>プロナス</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス <td>デコリオネート胚</td><td>11459643001</td></tr><tr><td>PBS</td><td>任意の商用ブランド</td><td></td><td>腫瘍/腫瘍細胞</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>任意の商用ブランドの</td><td></td><td>胚の薬物治療</td></tr><tr><td>シンボアトランスファーピペット</td> 任意の<td>商用ブランドの</td><td></td><td>胚の薬物治療</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>任意の市販ブランド</td><td></td><td>懸濁液中の腫瘍細胞をカウントするための</td></tr><tr><td>N2</td><td>任意の市販ブランド</td><td></td><td>マイクロインジェクターのセットアップ用</td></tr></tbody></table>

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

腫瘍細胞移植は、癌細胞増殖、移動、および宿主応答を制御するメカニズムを定義するとともに、治療に対する潜在的な患者の応答を評価する重要な技術である。現在の方法は、腫瘍移植片の拒絶を避けるために、同系または免疫不全動物の使用に大きく依存する。そのような方法は、免疫腫瘍細胞相互作用の分析をしばしば妨げる特定の遺伝的株の使用を必要とする、および/または特定の遺伝的背景に限定される。ゼブラフィッシュの代替法は、腫瘍細胞を短期アッセイ（ すなわち、 3〜10日）で使用するために移植する、3日前に胚の脳における不完全に発達した免疫系を利用する。しかしながら、これらの方法は、宿主の致死性を引き起こし、腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的な研究を妨げる。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ脳腫瘍組織の長期的な同所性移植のための単純かつ効率的な方法を記載している。2日齢の免疫能のあるゼブラフィッシュの第4脳室に送達する。この方法は、1）浸潤および播種などの腫瘍細胞の挙動の長期間の研究; 2）薬物に対する耐性腫瘍応答; 3）腫瘍進展および/または異なる宿主の遺伝的背景の影響の研究のための腫瘍の再移植。要約すると、この技術により、がん研究者は遠隔地の生着、侵入、成長を評価するだけでなく、数ヶ月にわたって化学スクリーニングや細胞競合アッセイを行うことができます。このプロトコールは、他の腫瘍型の研究に拡張することができ、化学療法抵抗性および転移のメカニズムを解明するために使用することができる。

腫瘍移植および生着この手順の模式的な概要を図1に示します。蛍光標識された腫瘍細胞を原発臓器部位から抽出し、単一細胞懸濁液を2-dpf mitfa w2ゼブラフィッシュ胚44の第4脳室に移植するために生成する。 図2は、中枢神経系の原始的な神経外胚葉性腫瘍（CNS-PNET）のゼブラフィッシュモデルを用いたこの方法の代表的な結果を示しており、 sox10プロモーターは、 p53欠損性前駆体前駆細胞におけるmCherryに融合した野生型NRASまたは活性化NRAS 17 。 メラノフォアを欠くmitfa w2ゼブラフィッシュ44変異体を用いて、より容易に視覚化した移植後の腫瘍細胞および/または成人期までの間に生じる。 Casper 50のような他の色素変異体を用いてさらなる画像形成透明度を提供することもできる。移植後24時間ほど早く、腫瘍細胞は周囲の脳組織に侵入するのが見られます（ 図2A 、3 dpf、矢印）。腫瘍移植片は、次の週（ 図2A 、8dpf）にわたって心室および周囲の脳組織内で成長し続ける。この時点で、腎臓の領域でも蛍光が観察される（ 図2A 、アスタリスク）。これは、腎臓機能を評価するためのアッセイとして蛍光色素を使用する先行研究と一致する、腎臓が移植からの細胞破片を濾過することによると考えられる51 。腫瘍細胞は増殖を続け、浸潤するので、28dpfまでゼブラフィッシュ脳全体に腫瘍の塊が見られる（ 図2A 、28dpf）。 図2Bの上部パネルに示す 。腫瘍移植は典型的には胚の80〜90％で達成され、腫瘍移植は成人期まで持続する。 3つの代表的な例が図2Bの下のパネルに示されている。これにより、腫瘍移植体を収穫し、数世代にわたって凍結または再移植することが可能になる。 腫瘍浸潤および薬物応答 図3Aは、GFP（腫瘍A）またはmCherry（腫瘍B）のいずれかで標識された2つの異なる腫瘍を全腫瘍によって採取する同時移植スキームを示すまたは解離（ここではFACSは使用しないが、必要に応じてFACSソートした腫瘍細胞を使用することができる）。腫瘍AおよびBは、異なる位置に由来してもよく、異なる癌遺伝子で誘導されてもよく、異なる遺伝的背景で誘導されてもよい。各腫瘍を単一細胞懸濁液に加工し、腫瘍細胞を1：1の比で一緒に混合し、2-dpf胚に移植する。生着、成長、侵入、および腫瘍A対腫瘍Bの普及などの腫瘍特性を、同じ宿主で観察することができ、技術および遺伝的背景に対する内部対照を可能にする。 図3Bでは、視神経のNRAS駆動のmCherry標識ゼブラフィッシュCNS-PNETおよび小脳のGFP標識CNS-PNETを採取し、単細胞懸濁液に加工した。細胞を計数し、各腫瘍の等しい数の細胞を一緒に混合し、2-dpf胚に移植した。 4つのd移植後、胚を共焦点顕微鏡で画像化した。 tectum腫瘍細胞（赤色）が小脳腫瘍よりも宿主の脳（矢印）に広範に移動することを実証する代表的な胚が示されている。 蛍光標識された腫瘍細胞を移植された胚は、腫瘍成長を阻害する化合物を同定するために薬物治療レジメンで使用することができる。 図3Cは、腫瘍移植を治療および画像化するための典型的なタイムラインである。移植24時間後に、胚に生着サイズを一定にしてアクセスさせ、処置群に分割する。提供された実施例では、 NRAS駆動のmCherry標識ゼブラフィッシュCNS-PNETを移植した胚を50μMのジメチルスルホキシド（DMSO）またはMEK阻害剤（AZD6244）で処理する。 図3Cに概説されるように、胚を5日間処理し、8dpfで画像化する。 図3D （左のパネル）は、<html> 2つの処置群の動物を示す。記載されているように、MEK阻害剤処理胚はDMSOで処理した胚よりも有意に低い蛍光量を有する。動物を画像化した後、薬物なしでタンクに移し、腫瘍の成長を2ヶ月間監視する。提供された実施例において、MEK阻害剤処理は、成魚において耐久性のある応答をもたらす（ 図3D 、右パネル）。薬物治療、画像化および定量化のさらなる詳細については、参考文献17を参照のこと。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig1.jpg" /> 図1：2-dpfゼブラフィッシュ胚の第4の心室への腫瘍細胞移植のプロトコル概略図。代替エンドポイント分析（セクション4.9-6）を含むプロトコルのセクション3から4の一般的な概略図。/55712/55712fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig2.jpg" /> 図2：腫瘍の移植および進行。 （A）mCherryで標識されたゼブラフィッシュ初代CNS-PNET17腫瘍細胞を、2-dpf胚の第4脳室に移植した。 3dpfでは、腫瘍細胞は周囲の脳組織に侵入するように見える（矢印）。 8dpfでは、腫瘍細胞は心室で増殖している。赤色腫瘍細胞はまた、周囲の脳組織および腎臓（アスタリスク）にも存在する。 28dpfで、腫瘍細胞は侵入し、宿主の脳全体に増殖する。 （B）トップパネル。 mCherry標識ゼブラフィッシュ脳腫瘍細胞を移植した7つの3-dpf胚。腫瘍細胞は、高い生着率（ すなわち、典型的には85/100胚）を有する何百もの胚に一貫して移植することができる。中と下パネル。受精後4〜8週間（wpf）の移植腫瘍を有する3種の代表的な成魚。腫瘍は蛍光顕微鏡で視覚化することができる。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig3.jpg" /> 図3：腫瘍侵襲と薬物反応の比較 （ A ）視床または小脳からのCNS-PNETs17をそれぞれmCherryまたはGFPで標識し、単一細胞懸濁液に加工し、1：1の比で一緒に混合し、2-dpf胚に同時移植する。 （ B ）視神経乳頭からのGFP標識小脳腫瘍細胞とmCherry標識腫瘍細胞との混合懸濁液を同時移植した6-dpf胚。 tにおける各腫瘍の侵襲性の差同じ受容者を蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。この例では、mCherry標識腫瘍細胞は、GFPで標識された腫瘍細胞よりも広範に移動する（矢印）。 （ C ）腫瘍細胞を移植された胚に対する薬物治療のタイムライン。 （ D ）DMSO対照または50μMMEK阻害剤のいずれかを用いて、治療レジメンの終わり（8dpf）および治療後8週間（8wpf）の代表動物の画像。腫瘍の負担は、記載されているように、蛍光を定量化することによって測定することができる17 。この実験において、mCherry標識腫瘍細胞の増殖は、MEK阻害剤処理胚において減少し、成人において耐久性応答に変換される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

癌細胞の移植は、癌のメカニズムおよび治療応答の同定のための重要なツールである。現在の技術は免疫不全動物に依存する。ここでは、腫瘍細胞の挙動およびインビボでの薬物応答の長期解析のために、ゼブラフィッシュ腫瘍細胞を免疫コンピテント胚に移植する方法を説明する。

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

この手順の全体的な目的は、免疫能を持つ動物ホストにおいて、浸潤や転移などの腫瘍細胞の挙動を長期的に評価し、潜在的な治療薬を試験することを可能にすることです。この手法は、薬剤反応の持続性や、浸潤および転移を促進するメカニズムなど、小児脳腫瘍分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、ホストへの毒性を最小限に抑えられることであり、これにより腫瘍細胞の持続的な生着が可能となり、結果として脳腫瘍生物学の長期的な研究が可能になります。この手法の意義は、薬剤投与後の腫瘍負荷をin vivoで直接評価できるため、脳がんの治療への応用にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな方は、腫瘍細胞懸濁液の濃度が高すぎても低すぎても、第四脳室に一定量を注入することが困難になり、苦労することがあります。まず、卵白水に1.2%アガロースを溶解させた50 mLの溶液を調製します。アガロースが溶解するまで溶液を沸騰させ、次いで05 milligrams per literのメチレンブルーを添加して補完します。最終溶液25 millilitersを10-centimeterのペトリ皿に注ぎ、凝固させます。残りの25 millilitersのアガロース溶液を42 degrees Celsiusの恒温水槽に入れます。次に、凝固した表面の中央に直径2インチのビーカーを置き、残りの1.2% agarose 25 millilitersを前の層の上に注ぎます。注入プレートは、注入前まで少なくとも30分間28 degrees Celsiusで保持するか、長期保存の場合は4 degrees Celsiusで保持してください。ニードルプラーを用いて、外径1.2 millimeters、内径0.9 millimetersの10-centimeterキャピラリーを引き抜き、針を作成します。プラスチック製パラフィンフィルムで包んだ顕微鏡スライドの上に、針を慎重に置きます。次に、カミソリを使用して針の先端を45度の角度で切り、先端に開口部のある針を作成します。脳腫瘍を担有する魚を安楽死させ、テキストプロトコルに従って腫瘍を摘出した後、P1000を用いて手動で腫瘍塊を破砕し、均一で濁った溶液になるまで処理します。ピペットまたは40µmのセルストレーナーを使用して、大きな粒子を除去します。その後、懸濁液を室温で290×g、5分間遠心分離し、上清を除去します。腫瘍細胞ペレットを100 µLの滅菌PBSで再懸濁し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。250 µLのPBSを用いて、細胞懸濁液5 µLを希釈します。次に、血球計数器を用いて細胞数をカウントします。懸濁液を290 ×gで3分間遠心分離します。上清を除去した後、滅菌PBSを用いてペレットを再懸濁し、目的の細胞濃度にします。移植操作の間、腫瘍懸濁液は28°Cのヒートブロックで保存してください。転送ピペットを使用して、麻酔をかけた胚を10〜20個、注入プレートの周辺部に移します。胚は側方に倒れ、脳室が明確に見え、アプローチ可能な状態である必要があります。必要に応じて角度付きプローブを使用して胚を調整し、注入プレートの外縁から離れた位置に配置します。次に、ゲルロードチップを用いて、1〜2 µLの腫瘍細胞懸濁液を注入針に充填し、針をマニピュレーターに挿入します。次に、針を45度の角度に保持したまま、マニピュレーターを手動で下げます。針が胚の頭部の直上かつ右側に約5 mmの位置に来るまで、マイクロマニピュレーターのx、y、z方向のノブを調整します。実体顕微鏡を用いて、針が胚の第四脳室を貫通するまで、マイクロマニピュレーターをx方向にゆっくりと調整します。針が心臓や卵黄を貫通しないように注意してください。安定した注入を行うには、胚を麻酔し、腫瘍を適切に分散させて細胞懸濁液にし、針を第四脳室に刺入させつつ心臓まで到達させないようにする必要があります。マイクロインジェクターのフットペダルを押し、腫瘍細胞懸濁液を注入します。注入が完了したら、新鮮な卵水を用いて、注入プレートからペトリ皿へ注入済みの胚を優しく洗い流します。次に、暗室にて蛍光実体顕微鏡下で注入済みの胚を観察します。注入圧、角度、針のサイズ、および細胞懸濁液の粘度の結果、脳室腔の25～50%が腫瘍細胞で満たされていることを確認してください。胚を28 °Cのインキュベーターに戻し、一晩静置します。翌日、既報の手法に従い、心臓や脳の正常な発達などの形態学的および生理学的特徴を調べることで、胚の生存率を評価します。転送ピペットを使用して、ペトリ皿の中央に4% methylcelluloseを滴下し、麻酔をかけた胚をそのmethylcelluloseの滴の中に入れます。角度付きプローブを用いて胚の向きを調整し、蛍光顕微鏡下で、移植サイズが一定であるかを確認します。腫瘍を維持させるため、受精後8日が経過した時点で、移植済みの胚を飼育水槽に移します。その後、テキストプロトコルに従ってイメージングおよび追加の解析を行います。本実験では、中枢神経系原始神経外胚葉性腫瘍細胞を、メラノフォア（黒色色素胞）を欠損したmitfaゼブラフィッシュ変異体に移植しました。移植後わずか24時間で、腫瘍細胞が周囲の脳組織に浸潤している様子が確認できます。腫瘍移植片はその後1週間にわたって脳室および周囲の脳組織で増殖し続け、腎臓の領域でも蛍光が観察されます。腫瘍細胞は増殖と浸潤を続けるため、受精後28日までにゼブラフィッシュの脳全体に腫瘍塊が認められるようになります。この図は、mCherryで標識した脳腫瘍細胞を移植したゼブラフィッシュの代表的なグループを示しています。腫瘍細胞の生着率は通常80%から90%であり、移植された腫瘍は成魚になっても持続します。本実験では、視蓋から採取したNRAS駆動・mCherry標識のゼブラフィッシュCNS-PNETと、小脳から採取したGFP標識のCNS-PNETを、腫瘍全体の解離によって回収し、単一細胞懸濁液に調製した後、1:1の比率で混合して移植しました。移植から4日後にイメージングを行ったこの代表的な胚では、赤色で示される視蓋腫瘍細胞が、小脳腫瘍よりも広範囲にホストの脳内へ遊走していることがわかります。習得すれば、3〜4時間で約300個の胚に注入することが可能です。この手順に従った後、生体動物イメージングや薬剤投与などの追加手法を実施することで、腫瘍細胞生物学、薬剤反応、および化学療法耐性に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。本手法の開発後、ゼブラフィッシュを用いたがんモデル分野の研究者は、小児脳がん治療のための新規阻害剤の探索が可能となりました。

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