マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達
June 4th, 2017
幹細胞は、その固有の腫瘍指向性のために脳腫瘍を治療するための有望な治療キャリアである。非侵襲性の鼻腔内幹細胞送達は、血液脳関門を迂回し、臨床翻訳の可能性を示す。この記事では、神経膠腫のマウスモデルにおける鼻腔内幹細胞送達の基本原理を要約する。
このプロトコルの全体的な目標は、神経膠芽腫の前臨床マウスモデルで治療用幹細胞を鼻腔内に脳に送達することです。この方法は、治療用幹細胞治療が前臨床脳腫瘍モデルで堅牢で治療効果を達成できるかどうかについて、神経腫瘍学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、鼻腔内投与により、閉塞性血液脳関門を二迂回する非侵襲的で反復可能な脳腫瘍治療の実施が容易になることです。
この技術は膠芽腫に限定されません。それは、他の脳悪性腫瘍や脳障害の治療に向けて広く拡張することができます。私の同僚である研究助教授のDou Yu、研究技術者のGina Liがこの手順を実演します。
まず、凍結ストックから目的の神経膠腫細胞を10回からT 75平方センチメートル培養フラスコあたり6個の細胞まで、加湿した二酸化炭素を添加した細胞培養インキュベーターで、必要に応じて15ミリリットルの血清補充培地または無血清培地で培養します。培養物が80%のコンフルエントに達したら、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで培養物を洗浄します。次に、室温で細胞をポイントゼロの5パーセントトリプシンで解離します。
次に、フラスコをタップして、コンテナの底からセルを切り離します。直ちに8〜9ミリリットルの血清含有培地で酵素を中和します。血清学的ピペットを使用して、得られた細胞懸濁液を円錐形のチューブに移します。
遠心分離により細胞を回収します。続いて、それぞれ10ミリリットルのPBSで2回洗浄します。ペレットを滅菌生理食塩水に2ポイントあたり10〜5番目の細胞の5〜20倍の濃度で懸濁し、細胞を氷上の滅菌マイクロ遠心チューブに移します。
つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認した後、約6週齢の免疫不全マウスをエタノール滅菌した定位固定装置フレームに適切な頭の位置でマウントします。挿入したハミルトンマイクロシリンジを、バリ穴の周りの頭蓋骨の表面に対して垂直に置きます。定位固定装置フレームのノブを使用して、マイクロシリンジの平らな先端をバリ穴の開口部にちょうど来るまで配置し、針が硬膜表面から3ミリメートル下に達するまでシリンジをゆっくりと下げます。
シリンジのゼロポイント5ミリメートルを引っ込めて、針先を硬膜の5ミリメートル下の2ポイントに維持し、1分間にわたってプリロードされた神経膠腫細胞の2ポイント5マイクロリットルを注入します。針をさらに1〜2分間所定の位置に置いてから、1分間かけてシリンジをゆっくりと引き抜き、細胞の逆流を最小限に抑えます。頭蓋外腫瘍を避けるために滅菌骨ワックスを塗布し、成長を追加し、7ミリメートルのステンレス鋼の創傷クリップを使用して創傷を閉じます。
その後、皮下注射により摂氏37度の滅菌乳酸リンガー溶液1ミリリットルを送達し、動物を加熱パッドの半分に位置する回復チャンバーに入れ、完全に回復するまで監視します。神経膠腫細胞移植後7〜8日で、放射線経路への頭部のみの曝露を準備します。その後、5日間連続して動物に2段階の放射線を毎日照射し、最後の照射線量後に生物発光イメージングによって腫瘍を評価します。
ヒト神経幹細胞の遺伝子改変では、幹細胞培養が75〜80%のコンフルエント度に達した場合、ポリブレン中の細胞あたり5つのウイルス粒子にCXCR4でコードされたアンチウイルスを接着し、直接培地に8〜16時間の培養を行います。インキュベーションの終了時に、形質導入培地を新鮮なブラストサイジン添加培地に交換して、形質導入細胞を正に選択します。示されているように、トリプシン消化によって細胞を収穫します。
標準的なフローサイトメトリー解析プロトコルに従って、抗CXCR4抗体および対応する同位体抗体コントロールを用いたフローサイトメトリーによるCXCR4発現レベルを検証します。次に、鼻腔内送達のために細胞を滅菌生理食塩水に懸濁します。神経細胞の低酸素プレコンディショニングのために、培養物が90%の密度に達したら、フラスコを1%の酸素が供給された加湿二酸化炭素インキュベーターに移します。
24時間後、トリプシン消化によって細胞を回収します。鼻腔内送達のために細胞を滅菌生理食塩水に懸濁します。ヒト神経幹細胞に腫瘍溶解性ウイルスをロードするには、標準的なアデノウイルストランスフェクションプロトコルに従って、細胞あたり50個の条件付き複製アデノウイルスウイルス粒子を幹細胞に感染させ、室温で2時間、定期的にタッピングします。
次に、細胞を新鮮な培地で3回洗浄して、結合していないウイルス粒子のいずれかを除去し、細胞を滅菌生理食塩水に懸濁して非transal送達します。細胞が実験的に適切であるように改変されたら、麻酔をかけた腫瘍担持動物をヒートパッドの上の清潔なドレープの仰臥位に置き、鼻孔を直立角度に維持するために頭の下にパッド入りの枕を置きます。枕の素材は、動物間の汚染を避けるために、アルコール拭きが可能なプラスチックまたは使い捨ての丸めたペーパータオルのいずれかである必要があります。
マウスが所定の位置にあるとき、マイクロピペットを使用して、目的の実験的なヒト神経幹細胞集団の2マイクロリットルを最初のマウスの各鼻孔に分注します。次の量の細胞を適用する前に、液滴の吸引を視覚的に確認します。各マウスに順番に配信を繰り返します。
その後、5 分待ってから、次のセル ラウンドを適用します。4ラウンドの細胞をすべて投与したら、完全に回復するまで動物を回復チャンバーに入れ、監視します。低酸素前処理とCXCR4の過剰発現は、フローサイトメトリーで示されるように、CXCR4受容体の細胞膜の存在を有意にアップレギュレートします。
腫瘍内のミクロンサイズの常磁性イオン酸化物標識幹細胞の存在は、プルシアンブルー染色によって確認することができます。神経幹細胞が示す腫瘍親和性は、腫瘍組織の組織学的解析によって視覚化できます。また、頭部のみの照射により、腫瘍容積の減少や、腫瘍や周辺組織におけるSDF-1のアップレギュレーションが誘導されることも組織解析から明らかになりました。
神経幹細胞におけるCXCR4受容体のアップレギュレーションを確認し、照射後の腫瘍親和性を促進します。生存率解析では、放射線照射のみは担がん動物の生存に有益であるが、放射線照射を受けた腫瘍溶解性ウイルスを負荷した低酸素神経幹細胞を投与した方が、腫瘍溶解性ウイルスを負荷した対照照射された非低酸素性幹細胞よりも、さらなる利益が得られることが示されている。腫瘍溶解性ウイルスのローディングと照射後のCXCR4形質導入神経幹細胞でも、有意な生存利益が観察されます。
さらに、低酸素神経幹細胞とCXCR4形質導入神経幹細胞の両方が、ウイルスヘキソンタンパク質染色によって証明されるように、腫瘍標的腫瘍性ウイルス粒子の有意に増強された腫瘍標的送達を示します。この鼻腔内デリバリー技術は、一度習得すれば、適切に行えば1時間で完了することができます。この手順を試行するときは、説明されているとおりにすべての手順をタイムリーに実行することを覚えておくことが重要です。
この技術により、前臨床げっ歯類モデルにおける広域スペクトル脳障害の治療可能な幹細胞の探索が可能になります。このビデオを見れば、マウス脳腫瘍の標的化のために、一貫性のある効果的な鼻腔内治療用幹細胞送達を行う方法について十分に理解できるはずです。人間の細胞やウイルスを扱う作業は危険である可能性があり、これらの手順を実行する際には、被験者の技術や適切な個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、グリオブラストーマのマウスモデルにおける脳への治療用幹細胞の経鼻投与について説明しています。この方法は、血液脳関門をバイパスする非侵襲的なアプローチを提供し、様々な脳腫瘍の治療に応用できる可能性があります。
主要な研究構成
科学分野
- 神経腫瘍学
- 幹細胞療法
- 経鼻投与法
背景
- 幹細胞には固有の腫瘍親和性があり、脳腫瘍の標的化に適しています。
- 経鼻投与は血液脳関門を回避する有望な技術です。
- この研究は、グリオブラストーマモデルにおける幹細胞療法の有効性を評価することを目的としています。
- この方法は他の脳障害や悪性腫瘍にも拡張できます。
研究目的
- グリオブラストーママウスモデルにおける幹細胞の治療効果を評価すること。
- 経鼻投与を治療法としての実現可能性を探ること。
- この技術の臨床応用可能性を調査すること。
使用した方法
- グリオーマ細胞の培養と注射のための準備。
- グリオーマ細胞の精密な投与のための立体視視台の使用。
- 腫瘍を持つマウスへの治療用幹細胞の経鼻投与。
- 治療後の生体発光イメージングによる腫瘍反応の評価。
主要な結果
- 経鼻経路による脳への幹細胞の成功的な投与。
- グリオブラストーマ治療における治療効果の可能性の実証。
- 改変された幹細胞におけるCXCR4の発現の検証。
- 低酸素前処置が幹細胞の効力を高めることが示されました。
結論
- 経鼻投与による幹細胞は脳腫瘍治療の有効な方法です。
- このアプローチは脳悪性腫瘍の非侵襲的治療選択肢につながる可能性があります。
- 臨床環境でこの技術を最適化し検証するためのさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Intranasal delivery of therapeutic stem cells offers a non-invasive, reproducible strategy for targeting glioblastoma and other brain malignancies in preclinical models. This approach bypasses the blood-brain barrier, enabling direct evaluation of stem cell tropism, tumor targeting, and therapeutic payload delivery. The method supports early-stage translational research and informs portfolio decisions on cell-based therapies for neuro-oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stem cell tumor tropism and migration in vivo.
- Supports functional validation of engineered stem cell constructs for brain tumor targeting.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating delivery route effects on therapeutic efficacy.
- Provides a platform for hypothesis-driven customization of stem cell modifications.
Screening & Assay Development
- Establishes a standardized, reproducible workflow for intranasal cell delivery in rodent models.
- Generates quantitative outputs via bioluminescence imaging and histological analysis.
- Enables comparative assessment of stem cell modifications, such as CXCR4 overexpression or hypoxic preconditioning.
- Supports assay scalability and cross-study reproducibility for preclinical screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for glioblastoma and other brain disorders.
- Enables evaluation of therapeutic payload delivery and tumor response in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapies toward IND-enabling studies.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of delivery strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This intranasal delivery protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuro-oncology cell therapies, supporting both target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on stem cell migration, tumor targeting, and payload delivery in brain models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing engineered stem cell variants and delivery conditions.
- Analytics: Enables measurement of tumor response, cell localization, and biomarker expression via imaging and histology.
- Translational Research: Bridges early discovery findings with preclinical efficacy and safety assessments in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to various stem cell types, genetic modifications, and tumor models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell-based targeting and delivery mechanisms.
- Operational Value: Standardizes non-invasive delivery and imaging protocols for cross-study reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy candidates targeting CNS malignancies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based neuro-oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, stereotaxic procedures, and stem cell culture.
- Needs access to imaging platforms (e.g., bioluminescence) and histological analysis tools.
- Demands rigorous cross-team standardization of cell preparation and delivery steps.
- Adaptable to different stem cell modifications and tumor models with protocol optimization.
- Safety precautions are essential when working with human cells and viral vectors.
