神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

このプロトコルを記述する簡易分離し培養 6 7 日古い子犬、CGNs の損失のための効率的な伝達と機能の研究、益からプライマリ マウス脳顆粒ニューロン (CGNs) と nmda 刺激による神経毒性、モデリング法低カリウムによって誘導される細胞死、DNA 損傷と同じ文化モデルを用いた酸化ストレス。

この手順の全体的な目標は、小脳顆粒ニューロンの健康な純粋な集団を作製し、それらを遺伝的に操作して、in vitro の一次培養におけるニューロン損傷のさまざまなメカニズムをモデル化することです。この方法は、神経損傷の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルを使用して、急性脳損傷および神経変性疾患後の神経損傷の根底にある分子メカニズムを調査します。

このプロトコールの主な利点は、培養システムを使用して、興奮毒性、酸化ストレス、DNA損傷、発生イベントなど、細胞死のさまざまなメカニズムをモデル化できることです。この方法は、ニューロンの損傷に関する洞察を得ることができますが、ラットの小脳ニューロンと一緒に使用して、成長因子やサイドイベントに応答したニューロンの活動と形態形成を研究することもできます。生後6〜7日齢のマウスの脳を摘出するには、鉗子を使用して頭をつかみ、マイクロ解剖ハサミで皮膚を頭に向かって前方に切ります。

皮膚を押し戻して頭蓋骨を露出させます。次に、ハサミの先で頭蓋骨を貫通し、前後左右に切り込みます。小脳を傷つけないように注意し、髄膜の特定と除去を容易にし、その後、鉗子を使用して頭蓋骨を剥がし、脳を露出させます。

鉗子またはヘラで、脳を冷解剖液にそっと引き出します。小脳を分離するには、硫酸マグネシウムを補給した解剖液に脳を入れ、溶液と脳を氷の上に保ちます。解剖顕微鏡下で、細い鉗子を使用して髄膜を切除し、硫酸マグネシウムを添加した解剖液で脳から小脳を解剖します。

これは、残りの髄膜を剥がすのに役立ち、層の間に入って小脳のひだをきれいにすることができます。髄膜の存在はニューロン培養であり、その結果、細胞が不健康になり、最終的には細胞死が生じます。そのため、培養を進める前に髄膜を完全に除去することが重要です。

その後、小脳を腹側に向け、脈絡叢の除去を確実にします。次に、1ミリリットルの硫酸マグネシウム補給解剖液が入った35mm皿に小脳を引き込みます。組織を細かく刻み、30ミリリットルの硫酸マグネシウム緩衝解剖液を含む50ミリリットルのチューブに移します。

このステップでは、刻んだ脳組織を含む15ミリリットルのチューブを、644倍のg、および摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、10ミリリットルのトリプシン解剖液を追加します。その後、テーブルを37°Cで15分間高速で振

2ミリリットルのトリプシン阻害剤溶液をチューブに加え、2分間穏やかに振とうします。その後、チューブを644倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。5分後、上清を取り除き、2ミリリットルのトリプシン阻害剤溶液2を加えてから、15ミリリットルのチューブに移します。

次に、溶液が濁るまで15ミリリットルのチューブ内の組織を粉砕します。5分間落ち着きます。次に、透明な上清を取り除き、1ミリリットルの塩化カルシウム補給解剖液を含む新しいチューブに移します。

ペレットを含むチューブの底に、さらに2ミリリットルのトリプシン阻害剤溶液を2つ加えます。もう一度漕ぎ、5分間落ち着かせます。上清を取り除き、前の手順で上澄み物が入ったチューブに追加します。

ほとんどの組織が機械的に解離するまで、このプロセスを繰り返します。0.3ミリリットルの塩化カルシウム補給解剖液を上清コレクションに追加します。チューブの内容物を混合し、室温でGの644倍で5分間遠心分離します。

その後、上清を取り除きます。ペレットに10ミリリットルの新鮮な培地を加えて混ぜます。次に、生細胞を数え、10の1.5×10の濃度に希釈します。

事前に調製したポリD-リジンプレートに細胞を播種します。4ウェルプレートの場合、サンプルの0.5ミリリミッターをプレート化し、ウェルあたり5番目の細胞に10の7.5倍を与えます。35ミリメートル皿の場合、サンプルの4ミリリットルをプレートにプレートし、プレートごとに6番目のセルに10の6倍を与えます。

カバースリップの場合、0.5ミリリットルをプレート化し、ウェルごとに5番目のセルに10の7.5倍を与えます。24時間後、AraCをプレートに添加して、グリア汚染を減らします。細胞を7〜8日間保持する場合は、3日目にこの処理を繰り返し、5%CO2インキュベーターで培養物を摂氏37度に維持します。

5日以上保持された培養物については、5日目から2日ごとに培養物にグルコースを給餌します。NMDAでニューロンの興奮毒性を誘導するには、in vitroで7日後、小脳顆粒ニューロンを100マイクロモルNMDAと10マイクロモルグリシンで1時間処理します。次に、培地を無処理で並行培養の馴化培地と交換します。

この濃度により、治療後24時間で50%の細胞死がもたらされます。ROS誘発性細胞死の場合、ニューロンを75〜100マイクロモルの過酸化水素で5分間処理します。5分後、パラレルカルチャーのコンディショニング培地に切り替えます。

過酸化水素は不安定であるため、24時間後に50〜70%の細胞死を誘発するレベルに濃度を最適化する必要があります。この濃度は通常75〜100マイクロモルです。DNA損傷による細胞死を誘導するには、小脳顆粒ニューロンを10マイクロモルのカンプトテシンで処理して、24時間以内に50%以上の細胞死を誘導します。

小脳顆粒ニューロンにおける低カリウム誘発性ニューロンアポトーシスの場合、in vitroで7日後に、25ミリモルカリウムを含む培地を5ミリモルカリウムを含む低カリウム培地に変更します。.ニューロンにRFP用のレンチウイルスを注入し、めっき時にMOI3で形質導入した。in vitroで7日間固定し、染色しました。

RFPシグナルMAP2とHoechstの共局在は、レンチウイルスによって完全に形質導入される健康なニューロンを示すことが示されています。ここに示す画像は、毒性を測定するためのアデノウイルスの異なるMOIに感染したニューロンの生死アッセイ分析を表しています。アデノウイルスに感染した小脳顆粒ニューロンは、MOIが25〜50のMOIでLacZを発現するため、毒性を最小限に抑えながら最大の効率を得ることができます。

このMOIで感染した場合、コントロールと比較して細胞生存率の差は1%未満です。これらの図は、制御小脳顆粒ニューロンとNMDAで処理された小脳顆粒ニューロンのヘキスト染色を示しており、細胞死を誘導しています。NMDA処理によるピクノーシス核の形成に注意してください。

これは細胞死の指標であり、100マイクロモルNMDAおよび10マイクロモルグリシンによる処理の24時間後の培養の約50%で見ることができます。一度マスターすると、このテクニックは、適切に実行すれば、6回のマウスポップで2時間半で実行できます。この技術を実行するときは、培養汚染のリスクを最小限に抑えるために、必要に応じて無菌技術と連鎖式手術器具を使用することが重要です。

その開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が初代マウスニューロンのニューロンの発達とニューロン損傷を研究する道を開きました。このビデオを見た後、小脳顆粒ニューロンを培養し、ウイルスを使用してそれらを遺伝子操作し、神経損傷のさまざまなメカニズムを誘発することができるはずです。この手順に続いて、免疫蛍光法や細胞生存率アッセイなどの他の方法を実行して、目的の遺伝子が興奮毒性、酸化ストレス、またはDNA損傷に応答して細胞の生存を促進するかどうかなどの質問に答えることができます。