生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーター マウスの画像

このプロトコルを記述する方法高解像度イメージング スペクトル領域光干渉断層法などと小さい齧歯動物, 眼科画像処理プラットフォーム システムを使用してに関する情報を取得するに活用できるレーザー眼底をスキャン網膜厚とミクログリア細胞の分布、それぞれ。

この手順の全体的な目標は、スペクトル領域光干渉断層撮影法と走査型レーザー検眼鏡法を使用して、それぞれ網膜の厚さとミクログリア細胞の分布に関する情報を取得することです。この方法は、網膜異常とミクログリア細胞の蓄積との相関関係に関する実験眼科分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、この情報を非侵襲的な方法でリアルタイムで取得できることです。

角膜スワブに対する反応の欠如を確認した後、マウスをプラットフォームの左側の腹臥位に置き、右眼窩をレンズに向けてください。プラス4ジオプターの硬質ガス透過性コンタクトレンズにヒドロキシプロピルメチルセルロースを一滴垂らして右目に塗布し、取得モジュールを開始します。Bスキャンの場合は、赤外線と光干渉断層撮影オプションを選択します アプリケーションと構造 で Retina を選択し、マイクロマニピュレーターを使用してレンズをマウスの目に近づけます。

網膜に焦点を合わせる前に、オキュラスデクスターインジケーターが選択されていることを確認してから、フォーカスノブを使用して、モニター画面の左側の眼底画像に大きな血管がはっきりと見えるまで網膜にズームインします。マイクロマニピュレーターを使用してカメラの位置を調整し、必要に応じて感度つまみを回して眼底画像の明るさを増減します。「パターン」メニューから「ラインスキャン」を選択し、マイクロマニピュレーターを使用して、スペクトル領域光干渉断層撮影法(SD-OCT)スキャンウィンドウの上部と下部のコーナー間でBスキャンを移動します。

「自動リアルタイム」の値を 9 以上に設定して高画質にし、「取り込み」をクリックします。すべての画像を取得したら、コンタクトレンズを目から新鮮なバランスの取れた塩溶液に移し、新しいヒドロキシプロピルメチルセルロースで角膜を水和させます。左目が撮影されたら、標準の30度光学系を反時計回りに回転させて取り外し、55度レンズを取り付けて2回目のイメージングを行います。

マウスを動かさずに自家蛍光を評価するには、コントロールパネルで赤外線を選択し、大きな網膜血管に焦点を合わせます。[自動蛍光イメージング]を選択し、必要に応じて感度ノブを使用して画像の明るさを調整します。感度ノブを1回押して、自動リアルタイム値を少なくとも67に設定します。

自動リアルタイム値に達したら、画像を取得し、感度ノブをもう一度押して平均化を停止します。実験的に適切であるように、焦点を調整して、さまざまな網膜層を視覚化します。すべての画像を取得したら、光学系に広視野102度レンズを装着し、先ほど示したように、各眼の自己蛍光を画像化します。

各画像の手動網膜の厚さを測定するには、最初の実験動物の名前をダブルクリックしてOCTスキャンを開きます。30度または55度のレンズで取得したBスキャンを開き、厚さプロファイルを選択します。[レイヤー セグメンテーションの編集] アイコンをクリックします。

ソフトウェアは、内部制限膜とベース膜を自動的に識別します。メンブレンの位置を手動で修正するには、変更するレイヤーと赤い円のオプションを選択します。マウスボタンを押したまま、対応するレイヤーが正しく配置されるまで円を移動して線を変更し、[保存して閉じる]をクリックしてウィンドウを終了します。

[レイヤー]オプションで、[Retina]を選択し、図の別の位置をクリックして、選択した位置の網膜の厚さを表示します。次に、網膜の厚さと視神経乳頭からの希望の距離を測定し、値をスプレッドシートにエクスポートします。Cx3cr1プロモーター下でgfpを発現するためのホモ接合体マウスからのこれらの代表的なSD-OCTシングルスキャンでは、30度と55度の両方のレンズ画像で網膜構造が明確に視覚化されています。

ただし、30度のレンズで得られたスキャンでは、脈絡膜の高い反射率が観察されます。SD-OCTに続いて、走査型レーザー検眼鏡検査では、55度または102度のレンズを使用して網膜内の個々のGFP陽性ミクログリア細胞を視覚化でき、102度のレンズで得られるより大きな眼底面積カバレッジが得られます。SD-OCT スキャンでは、内側の境界と基部膜の網膜境界を手動で補正した後、視神経乳頭からの同じ距離を測定すると、通常、30 度と 55 度のレンズ間で網膜の厚さ測定値の良好な相関が観察されます。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば50分以内に完了することができます。開発後、この技術は、実験眼科分野の研究者がin vivoで小さなげっ歯類の網膜病理を調査する道を開きました。