リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

このプロトコルは、アブラムシなどの半翅目昆虫の摂食によって生成される植物のカルシウム信号の分析のための簡単な方法をについて説明します。シロイヌナズナを用いたGFP カルシウム センサー GCaMP3 と変換高時間・空間分解能によるカルシウム動態のリアルタイム生体内イメージングを可能にします。

この顕微鏡プロトコルの全体的な目標は、昆虫が葉から餌を食べる際のin vivo植物カルシウム動態を測定することです。この方法は、植物がアブラムシの害虫をどのように検出して応答するかなど、植物アブラムシの相互作用に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生きた昆虫が葉から餌を与えている間に、生体内で植物のカルシウムシグナルを検出できることです。

この方法は、アブラムシの摂食中のカルシウムシグナル伝達の役割についての洞察を提供することができますが、新しい昆虫や植物などの他のシステムに適用したり、塩などの非生物的ストレスに応答するシグナルを検出したりすることもできます。35S:GCaMP3シロイヌナズナ植物を育てることから始め、テキストプロトコルに記載されているように11日目にアブラムシを育てます。実験の19日目に、制御された環境室から苗を取り出します。

鋭利なハサミを使用して、各植物から最大の葉をはがします。次に、ピンセットを使用して、各葉を上向きにして、井戸ごとに300マイクロリットルの蒸留水を含む96ウェルプレートの別々の井戸に配置します。葉の剥離ストレスを軽減するため、プレートを透明なラップとアルミホイルで覆い、室温で一晩放置します。

20日目に、11日目に設立されたコロニーから老齢のアブラムシを収集し、感染した植物を土壌から蓋付きの透明な箱に移します。実験中は、必ず箱の中に入れておくようにしてください。96ウェルプレートからアルミホイルを取り出し、蛍光実体顕微鏡に移します。

GCaMP3の蛍光が葉脈に見えるようになるまで、光の露出を調整します。ズームで倍率を調整すると、1つのフレームで4つのウェルを観察できます。湿った絵筆を使用して、顕微鏡下で1つのアブラムシを切り離された葉に移します。

空の絵筆をコントロールとして、隣接する葉に軽く触れます。アブラムシが逃げるのを防ぐために、ラップをプレートの上に戻します。葉の蛍光を、処理されたアブラムシと未処理のアブラムシのペアで記録します。

まず、内蔵の顕微鏡ソフトウェアで「実験を開始」をクリックします。測定値を 50 分間記録した後、「実験の停止」をクリックします。葉からアブラムシを取り除きます。

さらに葉のペアで測定を繰り返します。データ収集を開始するには、Image ソフトウェアを開きます。画像ファイルをフィジーまたはImageJにインポートします。

[画像]、[タイプ]、[32ビット]の順にクリックして、記録した画像を32ビットに変換します。まず、[画像]タブをクリックし、[プロパティ]を選択します。測定スケールをピクセルに設定し、時間枠を顕微鏡観察中と同じ時間間隔に設定します。

顕微鏡で昆虫の動きを追跡し、アブラムシが1つの場所に5分以上定着しないサンプルを廃棄します。カーソルを使用して、GFPシグナルについて分析する組織の領域の周囲に関心領域(ROI)を配置します。楕円ツールで楕円を描画してROIを作成し、編集、選択、指定を使用してサイズを編集します。

処理されたリーフで選択されたものと同等のリーフの領域内の未処理コントロールのROIを選択します。生の蛍光値、または ROI の F を経時的に分析するには、Time Series Analyzer プラグインを使用して、目的の ROI で [Plugins and Time Series Analyzer] をクリックし、[Add] ボタンをクリックします。ROI を選択した後、[平均を取得] を選択して、その ROI の各フレームの F 値のテーブルを表示し、このデータをスプレッドシートにコピーします。

次に、フリーハンド選択ツールを使用して、供給部位のGFP信号の領域を選択します。供給部位の最大信号のアウトラインを作成し、[分析]、[測定]の順にクリックして、この形状の面積を計算します。フィードサイトの速度を計算するには、[プラグイン]、[トラッキング]、[MTrackJ]の順にクリックして、MTrackJプラグインを使用します。

次に、[追加]ボタンをクリックし、信号が最初に表示されたときに信号の中央にあるカーソルをクリックします。シグナルの最も遠いスプレッドのポイントで、シグナルの端をもう一度クリックします。最後に、信号の速度を計算するには、[測定] をクリックします。

32 ビット画像ファイルをヒートマップに変換するには、NucMed_Image LUTs プラグインを使用します。「プラグイン」メニューから「NucMed」を選択し、「ルックアップ・テーブル」をクリックします。「青、緑、赤」を選択して、画像をヒートマップに変換します。

アブラムシに関連付けられた GFP 信号を視覚化するのが難しい場合は、[プロセス]、[コントラストの強化] の順にクリックし、[飽和ピクセルの割合] を調整して、ヒート マップのコントラストを強化します。最後に、Time Stamper を使用して [Plugins] を選択し、[Time Stamper] を選択して時間情報を追加します。開始時間をゼロに設定し、顕微鏡検査に使用する時間間隔に基づいて間隔を設定します。

アブラムシが落ち着いてから数分以内に、摂食部位周辺のGFP蛍光が非常に局所的に増加し、処理された葉の細胞質カルシウムの上昇が示されました。一方、対照葉では、カルシウムの動態は比較的安定しています。処理した葉の中には、最初のピーク後にGFP蛍光の二次的な増加を示すものがあります。

アブラムシで処理された葉の経時変化ビデオは、時間の経過に伴うGCaMP3蛍光のダイナミクスを示しています。全身性中肋骨および全身性側組織領域、アブラムシの摂食部位の周囲にない領域では、治療済みサンプルまたは対照サンプルのいずれでもカルシウムの上昇は検出されません。この手順を試みるときは、触れることによるカルシウム信号を引き起こしたり、アブラムシが落ち着くのを妨げたりする可能性があるため、葉や昆虫に不必要に触れたり邪魔したりしないように覚えておくことが重要です。

一般に、この方法に不慣れな個体は、アブラムシが餌を与えるために葉に定着するのを確実にするのに苦労するかもしれませんが、これは昆虫をできるだけ扱わないようにすることで最小限に抑えることができます。このビデオを見れば、昆虫が葉から餌を食べるときに、蛍光バイオセンサーを使用してin vivoで植物カルシウムの動態を測定する方法についてよく理解できるはずです。この手順からさらに、アブラムシの検出やカルシウムシグナルの取り込みに関与する遺伝的メカニズムなどの追加の質問に答えるために、突然変異植物の葉を使用することができます。