ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

このプロトコルの全体的な目標は、局所的な表面接着性のナノスケール制御を可能にする大規模なデンドリマーベースの不均一なナノパターンを取得することです。記載されている方法は、細胞接着および軟骨分化の研究に適用される。デンドリマーを盛り上げたナノパターンは、ナノスケールで表面の接着性を局所的に制御することを可能にします。

細胞接着体RGDペプチドで修飾された第1世代のポリナノマーを使用して、ナノパターンを作成します。これらは、顕微鏡技術による走査型によって特徴付けられ、細胞接着および分化研究に使用されます。次に、顕微鏡法と免疫染色技術の結果を分析します。

最初のステップは、作業基板を準備することです。カスタマイズされた正方形のスライドガラスは、ダイヤモンドチップカッターで顕微鏡スライドを切断することによって製造されます。1.25 x 1.25センチのサイズのスライドを作成します。

スライドを脱イオン水で洗い、続いて96%エタノールで洗い、自然乾燥させます。圧力管に200ミリグラムのPLLAを加え、10ミリリットルのジオキサンを加えて、2%PLLA溶液を調製します。攪拌棒を追加し、チューブをしっかりと閉じます。

混合物を摂氏60度のグリセリン浴で穏やかに攪拌しながら24時間温めます。PLLA溶液が入ったガラスバイアルにスライドガラスを、摂氏60度の清潔なホットプレートに置きます。必要な温度に達するまで少なくとも10分待ちます。

スライドガラスをスピンコーターステージに置き、選択したプログラムを実行することにより、PLLA溶液でガラス基板をスピンコートします。我々は、均質なコーティングを確保するために、500 rpmのプレステップで500 rpmのプレステップで毎秒1、500 rpmの加速で30秒間、30秒間で300 rpmを選択します。スピンコーティングされたグラスは冷蔵庫で保管できます。

脱イオン水中のRGD-Cys-D1デンドリマーの0.77ミリグラム/ミリリットル溶液である溶液Aを10分間調製し、超音波処理します。次に、脱イオン水中にそれぞれ10〜2%および10〜5%溶液BおよびCのデンドリマー溶液を調製します。溶液Cを10分間超音波処理し、次のデンドリマー溶液、D、E、およびFを脱イオン水にも調製します。

ソリューションD、2.5x10から8%ソリューションE、10から8%およびソリューションF、4 10から9%これらのソリューションを使用まで冷蔵庫で保存します。細胞培養キャビンのUVランプ18 PLLAコーティングガラスを13分間使用して、無菌にします。各デンドリマー溶液を10分間超音波処理します。

直径0.22 μmのフィルターで、PLLAコーティングガラススライドを12ウェルプレートに取り付け、細胞培養キャビンの層流でデンドリマー溶液をろ過します。室温でキャビン内に16時間放置し、滅菌脱イオン水で洗ってください。ポジティブコントロールサンプルについては、PBSで滅菌フィブロネクチン溶液を調製し、レプリカを溶液と室温で細胞培養キャビンで1時間インキュベートします。

PBSで洗ってください。残りの3つのPLLAコーティング基板は、ネガティブコントロールのレプリカとして機能します。ナノパターントポグラフィーは、空気中でタッピングモードで操作するAFMで解析されます。

ばね定数が40ニュートン/メートル、共振周波数が300キロヘルツのシリコンカンチレバーをAFMチップホルダーに取り付けます。AFMステージ上にナノパターン基板を載せた状態で、接触するまで表面に近づき、表面に過度の圧力をかけずにデンドリマー形状をイメージングできる振幅設定点を選択します。条件ごとに3つの独立した基板の基板あたり5x5マイクロメートルの少なくとも3つの代表的な画像を登録します。

取得した画像をAFM処理ソフトウェアで処理します。処理されたAFM高さ画像でデンドリマーを選択し、対応する画像のしきい値を取得します。パーティクルの精度を取得し、それらを使用して最小のパーティクル間距離を取得します。

Z の最小粒子間距離を対応する粒子精度に合わせ、最小粒子間距離の確率制御プラグを求めます。プロットのカラースケールを調整して、局所的なRGD表面密度が70ナノメートル未満の領域を可視化します。これらの領域の面積を定量化するには、画像上で領域を選択し、しきい値を生成します。

初期の継代からの間葉系幹細胞に由来する市販のヒト脂肪、できれば5つ未満を使用してください。幹細胞増殖培地で37°Cおよび4.6%CO2雰囲気で、70%または80%のコンフルエントに達するまで培養します。軟骨新生誘導培地の基質上に3, 000細胞/平方センチメートルの細胞密度で細胞を播種します。

媒体は3日ごとに交換してください。凝縮ステップは、培養の初日から観察でき、その進化は、すべての培養ラボで光学位相コントラスト顕微鏡で追跡できます。細胞を10%ホルマリン溶液で室温で20分間固定し、PBSで洗浄します。

PBSに塩化アンモニウムの50ミリモル溶液を添加することにより、フラアルデヒド基をロックします。室温で20分間放置します。PBSで洗ってください。

PBS中の1%アルブミンのブロッキング溶液中の0.1%サポニン溶液で細胞を室温で10分間透過化します。ブロッキング溶液中の一次抗体と室温で1時間インキュベートします。PBSで洗ってください。

ブロッキング溶液中の二次抗体と室温で1時間インキュベートし、光への曝露を避けます。PBSで洗って乾かします。サンプルに顕微鏡用封入剤を塗布し、カバースリップで優しく覆います。

焦点接着タンパク質パキシリンの免疫染色サンプルを軟骨形成誘導の1日後に、および初期の軟骨形成マーカーであるコラーゲンIIαIの免疫染色サンプルを、直立共焦点顕微鏡を使用して5日間の軟骨誘発後に画像化します。0.5 マイクロメートルや 1 マイクロメートルなどの代表的な間隔でセクションを収集します。細胞凝縮物の基底ゾーンからパキシリンについて染色した画像をフィルタリングします。

背景を削除し、滑らかにし、8ビットファイルに変換します。経験的に選択されたしきい値を設定して、バイナリにします。3つの独立したサンプルの条件ごとに最低3つの細胞凝縮物を処理します。

選択した領域を定量化し、画像内の細胞核の数で割った領域の対応する割合として表します。コラーゲンIIαI染色を定量するには、共焦点Zプロジェクションを作成します。結果の画像をフィルタリングし、背景を削除し、滑らかにし、しきい値を設定します。

対応する細胞凝縮物の面積に対する、サンプルあたりの最大コラーゲンIIαI面積の投影面積の合計を定量化します。溶液中の初期デンドリマー濃度を変化させる異なるナノパターン構成を得ることができる。ナノパターンは、AFM解析と確率等高線プロットにより、構築した最小粒子間距離を可視化することができます。

これらは、ローカル RGD サーフェス密度が最も高いサーフェス上の領域を強調表示します。デンドリマーナノパターンは、細胞接着研究に使用されます。接着性は、局所的なRGD表面密度とともに増加します。

ポジティブコントロールとデンドリマー凝集体を含む表面では、この相関は失われます。局所的なRGD表面密度の影響は、軟骨形成において試験され、細胞の凝縮と分化の両方が中間の接着性を示すナノパターンによって支持されます。結論として、細胞応答に対する局所RGD密度の影響に対処するための3つのテーブル法におけるデンドリマーベースのナノパターン。

ナノパターンは、細胞培養で一般的に使用される対応する均質な表面で細胞接着をより効率的に維持します。分化実験では、細胞の基質への中間的な接着性が、間葉系細胞の凝縮と早期のクロノジェニック分化に有利に働きました。デンドリマー末梢増殖の容易な改変により、ここで述べる方法は、細胞に密度効果を有する全ての過剰なリウマチ層にさらに拡張することができる。