アポトーシス細胞の食作用アッセイショウジョウバエ胚

本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの in vivo 食作用を測定して、アポトーシス細胞の巻き込みに関与する特定の遺伝子の関与を評価することです。この方法は、アポトーシス細胞の巻き込みに関与するメカニズムに関する免疫学および発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞を簡単かつ正確にin vivoの食作用レベルを測定できることです。

この技術の意味は、炎症を引き起こす危険な細胞を除去するために食作用によるアポトーシス細胞が必要であるため、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療にまで及びます。まず、200匹の成魚の雌と200匹の成虫の雄のショウジョウバエと、酵母に新鮮なブドウジュース寒天のプレートを50ミリリットルの円錐形チューブに加えます。スポンジキャップでチューブを閉じ、16°Cの光の中でハエを2〜3日間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、ハエを暗闇の中で摂氏25度に1時間移動させ、古いプレートを酵母を含まない新しいプレートと交換します。ハエが2時間産卵するのを待ちます。次に、プレートを摂氏16度で26時間インキュベートします。

翌日、ペイントブラシを使用して、胚を0.2%Triton X-100を添加した1ミリリットルのPBSに移します。2回の洗浄後、1.2ミリリットルの次亜塩素酸ナトリウム溶液を胚に加えて、絨毛膜を取り除きます。3分後、新鮮なPBSとTriton X-100で胚を4回洗浄します。

洗浄した胚を6cmのアガロースプレートに移し、プレートを解剖顕微鏡下に置きます。マイクロチップを使用してステージ16の胚を同定します。マイクロピペットを使用して、ステージ16の胚のうち約50個を1.5ミリリットルのマイクロ試験管に移します。

胚細胞を単離するには、まず胚を150マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。胚を新しい1.5ミリリットルのマイクロ試験管に移します。次に、200マイクロリットルのコラゲナーゼを加え、ペレットミキサーで胚を30回均質化します。

均質化の最後に、胚細胞を10回粉砕し、細胞懸濁液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。細胞を摂氏37度で1分間インキュベートします。次に、細胞をさらに10回回転させ、さらに1分間摂氏37度のインキュベーターに戻します。

2回目のインキュベーションの終わりに、800マイクロリットルのPBSを細胞に加え、遠心分離によって細胞を回収します。70ミクロンの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過する前に、200マイクロリットルのトリプシンでペレットを再懸濁します。800マイクロリットルのPBS中に40マイクロリットルの熱不活性化ウシ胎児血清で酵素活性を停止し、遠心分離によって細胞を収集します。

沈殿した細胞を200マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、別の遠心分離で細胞を回収します。ペレットを30マイクロリットルのPBSに再懸濁し、細胞をアミノプロピルトリエトキシシランでコーティングされたスライドガラスに取り付けます。細胞が付着したら、ピペットを使用してスライドから余分なPBSを取り除き、60〜70マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。

10〜15分後、固定液を取り出し、PBSで細胞を1分間洗浄します。抗Croquemort抗体で細胞を免疫染色するには、まずスライドをメタノールに連続的に浸し、次にPBSに0.2%Triton X-100を添加し、続いてPBSのみを浸します。次に、PBSと0.2%Triton X-100に溶解した20マイクロリットルの5%全豚血清で、室温で20分間、非特異的結合をブロックします。

余分なブロッキング溶液を取り除き、摂氏4度で20マイクロリットルの抗Croquemort抗血清で細胞を一晩標識します。.翌朝、スライドをPBSとTriton X-100で洗浄し、10分間のインキュベーションを5回行います。最後の洗浄後、スライドをPBSで10分間すすぎます。

次に、20マイクロリットルのアルカリホスファターゼ標識抗ラットIgGで細胞を標識し、室温で1時間。インキュベーションの最後に、スライドをPBSとTriton X-100で5回洗浄し、その後、緩衝液に10分間浸します。次に、ホスファターゼ基質溶液で細胞を標識し、光学顕微鏡で細胞を観察します。

血球顆粒に強い紫色のシグナルが現れたら、余分な基質を取り除き、EDTAを添加したバッファーにスライドを5〜10分間浸します。インキュベーションの終了時に、細胞を5分間のPBS洗浄液2回で洗い流し、平衡緩衝液で10分間処理します。溶液を除去した後、20マイクロリットルの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ溶液で摂氏37度で1時間細胞を標識します。

次に、スライドから溶液を取り出し、細胞を0.5ミリリットルに浸し、洗浄バッファーを17ミリリットルの水に10分間浸します。次に、細胞を5分間のPBS洗浄液を3回洗浄し、室温で30分間、20マイクロリットルの抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼで標識します。インキュベーションの終了時に、示されているように細胞をPBSで4回洗浄し、アポトーシス細胞が茶色に変わるまでスライドをペルオキシダーゼ基質に30秒刻みで浸します。

最適な染色が達成されたら、スライドを水に浸してペルオキシダーゼ反応を停止します。これらの画像では、血球と呼ばれるショウジョウバエのマクロファージを染色し、血球マーカーのCroquemortと、分散した胚細胞中のTUNELによる食作用アポトーシス細胞の存在について、先ほど示したように染色しました。Croquemort陽性細胞は、細胞の小さな顆粒に紫色のシグナルを示しますが、TUNEL陽性細胞は、全体で茶色のシグナルを示します。

あるいは、顆粒だけでなく血球全体を染色する抗GFP抗体で血球を染色することもできます。この実験では、野生型または単一変異型胚の総血球に対する貪食性血球の比率を解析し、野生型ハエよりも両方の単一変異株で食作用指数が低く、血球とアポトーシス細胞の総数が類似していることを示し、アポトーシス細胞の飲み込みのための変異遺伝子の必要性を示しました。単一遺伝子のRNAiノックダウンも食作用指数を低下させますが、血球とアポトーシス細胞の総数は同等であり、アポトーシス細胞を介した食作用における調査済みの食作用受容体の関与をさらに強調しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約15時間で完了できます。この手順を試みる際には、細胞の食作用能力を最適に評価するために、過剰な血球マーカーとTUNEL染色を避けることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、すべてのショウジョウバエ胚のin situ食作用アッセイを実施して、飲み込み部位または血球の分布に関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、免疫学分野の研究者がショウジョウバエのアポトーシス細胞の巻き込みのメカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見れば、ショウジョウバエの胚におけるin vivo食作用の測定方法について十分に理解できるはずです。