肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

この方法は、がん転移の達成における肺のコロニー形成の役割に関するがん転移分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、がんの転移中に早期に血管外に放出されたがん細胞を肺で視覚化できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるCheng-Han Yangです。

腫瘍細胞培養が70〜80%のコンフルエントに達したら、1回の洗浄につき2ミリリットルの滅菌PBSで培養物を2回洗浄し、0.5%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを培養皿に加えます。直ちに800マイクロリットルの上清を取り除き、細胞の大部分がプレートから分離するまで、培養皿を摂氏37度に30〜60秒間置きます。10%FBSを添加した1ミリリットルの新鮮な培地を加えて反応を停止させ、1000マイクロリットルのピペットを使用して細胞溶液を激しく混合します。

得られたシングルセル懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により細胞を回収します。次に、腫瘍細胞ペレットを20%FBSを添加した1.5ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞を摂氏37度で2時間回転させます。インキュベーションの終了時に、トリパンブルー排除法で生細胞をカウントし、遠心分離によりそれらを回収します。

2回目の遠心分離のためにペレットを1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁し、10%FBSと20マイクロミリリットルのCFSEを添加した500マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。暗所で摂氏37度で10分後、細胞を遠心分離し、別の遠心分離のために1パーセントのFBSを補充した4ミリリットルの培地にペレットを再懸濁します。最後の洗浄後、FBS濃度を含まない新鮮な培地のミリリットルあたり5倍から6番目の腫瘍細胞に細胞を再懸濁し、細胞を氷上に置きます。

次に、4〜6週齢の雄C570 Black Sixマウスの尾部を5〜10分間温めて尾静脈を拡張し、26.5ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで細胞を完全に混合します。シリンジに200マイクロリットルの細胞を慎重にロードし、マウスを拘束具に入れます。次に、拡張した尾静脈の内腔に細胞の全体積を注入します。

適切な注射後の時点で、腹部から胸部まで縦方向の皮膚と皮下組織を切開し、胸膜腔を開いて心臓と肺を露出させます。滅菌外科用縫合糸を使用して、上大静脈と下大静脈を結紮して滲出液の逆流を防ぎ、ハサミを使用して左心室に2〜4ミリメートルの亀裂を作り、肺からの灌流液の排出を促進します。次に、3ミリリットルの注射器を使用してPBSを右心室に注入し、肺が赤みがかった色から完全に青白くなるまで、連続吸引を使用して排出された溶液を取り除きます。

肺の灌流を成功させるために、上大静脈と下大静脈を適切に固定するように注意してください。肺を採取した後、葉を6センチの皿のカスタムメイドの肺ホルダーに入れ、肺をホルダーの網目状のテクスチャに固定します。ローブをPBSで覆って湿らせ、培養皿を共焦点顕微鏡のイメージングステージに置きます。

5倍対物レンズを選択し、フィルターホイールをNIBAに回転させます。488ナノメートルのレーザーを使用してCFSEを励起し、肺葉内の蛍光青色で標識された腫瘍細胞を鮮明に視覚化できるようにします。フィルターホイールをR690に回転させて、ピクセルあたり2マイクロ秒のスキャン速度でスキャンし、高電圧ゲインとオフセットレベルを最適化します。

次に、1ピクセルあたり10マイクロ秒のスキャン速度を使用して、5つの12×5の12ピクセル蛍光画像をキャプチャします。今示した染色法を使用して、腫瘍細胞は用量依存的な方法でCFSEで効果的に標識されます。標識の蛍光強度により、20マイクロモルの濃度で1ミリリットルあたり5番目のルイス肺癌細胞の6倍でほぼプラトーに達します。

ちょうど示したように、収穫前の肺灌流は、画像分析の前に非特異的に切り刻まれた循環腫瘍細胞の肺血管系をクリアします。蛍光共焦点顕微鏡法は、採取および灌流された肺葉内にコロニー形成CFSE標識腫瘍細胞の存在を明らかにします。適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して蛍光画像を白黒に変換すると、肺のコロニー形成の定量化が容易になります。

ルイス肺がん細胞を発現するフィブロネクチンを発現するフィブロネクチンまたはスクランブルフィブロネクチンを静脈内送達すると、注射後38時間および45時間後に採取された肺組織中のフィブロネクチン発現細胞の数が有意に減少し、肺葉のコロニー形成と腫瘍の発生におけるフィブロネクチンの役割が強調されています。この手順を試みるときは、付着していない細胞を洗い流すことができるように、肺を慎重に灌流することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、がん転移の分野の研究者がマウスゼログラムモデルで腫瘍細胞を循環させることにより肺のコロニー形成を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、腫瘍細胞懸濁液を蛍光標識する方法、腫瘍細胞を静脈内接種してマウスの肺を灌流する方法、共焦点蛍光顕微鏡を使用して転移した腫瘍細胞を画像化する方法について十分に理解できるはずです。