Name: 肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶ肺植民地化アッセイにより、循環腫瘍細胞の肺定着メカニズムを可視化する方法。CFSE蛍光標識と共焦点顕微鏡を用いて、転移初期のがん細胞を観察し、ポリFNの役割を解明する。

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テクニカル サポートのため博士明分チャン ・ チェンさんは屋新を感謝致します。この作品は、台湾の科学技術省によって支えられた (ほとんど-103-2325-B-006-009、ほとんど-104-2325-B-006-001、ほとんど-105-2325-B-006-001、および MOST-106-2320-B-006-068-MY3) 厚生省と福祉 (MOHW106-TDU-B-211-144004)。また、国立成功大学、医学のコア研究室から多光子顕微鏡のサポートを感謝しております。

すべてのマウスの実験は、当研究所 (ケア、NCKU 医科大学実験動物の使用のためのガイド) のガイドラインに従って行われました。
1. 楽器、文化、メディア、料理の準備
<ol><li>実験的プロトコルを開始する前に取得 (尾静脈注射) を 26 G/0.5 cm の針を用いて 1 mL 注射器滅菌手術用縫合糸、3 mL シリンジ (肺灌流) の 24 G/3 cm 針ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM)、トリプシン EDTA 溶液 (5グラム/L のトリプシンと 0.53 mM)、ウシ胎児血清 (FBS)、1 x PBS (137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2フォー4と 1.8 mM KH2PO4)、6 cm 文化料理。</li>
</ol>2. 準備中と懸濁液中に腫瘍細胞の回復
<ol><li>滅菌ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM) 10% または 20% を含む準備 FBS たて 0.05%、1 x PBS 2 mM L グルタミンを追加およびトリプシン-EDTA。</li>
	<li>10 %dmem で細胞の培養 37 ° C で FBS、培養皿で 70-80% の合流があるまでそれらを育てます。</li>
	<li>2 mL の滅菌 1x PBS で 2 回洗濯に続いて、料理から文化メディア (DMEM) を削除します。</li>
	<li>0.05 %1 mL を加えてトリプシン-EDTA 料理に徹底的にすべてのセルをカバーするため。すぐに 800 μ L のソリューションを削除し、料理にのみ 200 μ L を残します。30 の 37 ° C で料理を孵化させなさい (携帯型) によって 1 分と細胞の大半がサスペンド状態になるまで待機します。</li>
	<li>新鮮な DMEM の 1 mL を追加 10% を含むと精力的にトリプシンの酵素活性を停止するお皿に直接 FB ピペットの細胞懸濁液を上下 1000 μ L ピペット単一細胞懸濁液を準備するとします。</li>
	<li>1.5 mL 遠心チューブにお皿からセルを転送、室温で 3 分間 162 x g 細胞をスピンします。</li>
	<li>上清を吸引し、37 ° C 2 時間の懸濁液で細胞を回転 1.5 mL 20 %fbs、エンド オーバー エンドを含む DMEM で腫瘍細胞を再懸濁します。 注: 媒体は回復中に黄色に変わったら場合、は、20% を含む新鮮な培地で古い培地を交換政府短期証券。</li>
</ol>3. 蛍光染色と Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) と懸濁液中に腫瘍細胞の解析
<ol><li>懸濁液中の細胞回復後、用量を染色する蛍光を滴定の室を数えるノイバウアーのトリパン ブルーと適切な生菌数をカウントし、尾静脈注射。</li>
	<li>3 分の 1 mL にペレット細胞滅菌 1x PBS、162 x g 3 分で室温の遠心分離によって続いて再懸濁します常温 162 x g で細胞をスピンします。</li>
	<li>500 μ L の 10 を含む 1x PBS でペレットの細胞を再懸濁します %fbs と 0、5、10、20、または用量調節の 40 μ M CFSE 37 oC 暗闇の中で 10 分間の細胞懸濁液を孵化させなさいと。</li>
	<li>スピン ・ ダウン 3 分間室温で 162 x g でセルと 4 ml の 1% を含む DMEM の小球形にされた細胞を再懸濁します FBS。この洗浄工程を 3 回繰り返します。DMEM 最終的な洗浄のためだけの 4 ml 小球形にされた細胞を再懸濁します。</li>
	<li>尾静脈注射や CFSE 分類された細胞を蛍光活性化細胞のソーティング (FACS) による単一細胞の蛍光強度を定量化するために対象します。 注: は、FACS 解析や尾静脈注射を実行する前に氷の上細胞を保ちます。</li>
</ol>4. 肺植民地化アッセイ
<ol><li>20 μ m CFSE 分類されるセルを準備 (ステップ 3.1 3.4 を参照)。 注: 腫瘍細胞、FACS 解析から滴定結果に基づいてラベル付けのため CFSE の作業量を決定する (ステップ 3.3 を参照)。</li>
	<li>4-6 週のツインテールを暖かい-古い男性 c57bl/6 マウス (6 マウス) マウス尾静脈を拡張するためのマウスでごとに 5-10 分のハロゲン ランプを使用。</li>
	<li>徹底的にミックスし、(5 × 106セル/mL の最終的な細胞密度) の細胞懸濁液で任意の気泡を回避 (26Gx1/2) 1 mL 注射器 CFSE 分類された腫瘍細胞を吸引します。</li>
	<li>慎重に 1 を注入 x106 CFSE 分類された腫瘍細胞マウス落で提出する必要がありますマウスの尾静脈に DMEM を 200 μ l 添加します。 注: 注入中尾静脈の内腔に針を直接配置した場合腫瘍細胞必要があります簡単に配信循環に注射器にハードにプッシュすることがなく。腫瘍細胞をプッシュするは難しいが場合、彼らほとんど挿入されている尾静脈外の皮下組織に。</li>
	<li>マウス静脈内 CFSE 分類された腫瘍細胞を受信した 2 つのグループに分ける: 1 つのグループは共焦点顕微鏡に続いて肺灌流を受けるし、肺植民地化アッセイおよび他の 1 の ImageJ 定量化が残される 4 - 5 だけで長期肺植民地における週間の試金します。</li>
	<li>20、38、45 h 以上との時間コースと用量依存の滴定の間に静脈内注入 1 × 106腫瘍細胞はよく受け入れられ、適切な anesthetizer2350 75 mg/kg zoletil 50, 担癌マウスを麻酔します。 注: 麻酔中の乾燥を防ぐためのマウスの目に獣医軟膏を使用。</li>
	<li>縦外科はさみで皮膚と胸部に腹部から皮下組織を切る。外科はさみと心臓と肺を完全に公開するための鉗子で胸腔内を開きます。 注: 血管を切断しないように注意ください。</li>
	<li>上大静脈 (SVC) と下大静脈 (IVC) 肺灌灌流液の逆流を防ぐために滅菌手術用縫合糸とを結ぶ。</li>
	<li>肺から灌流液を排出する裂 (約 2-4 mm) を開く手術ハサミで左心室の壁をカットします。</li>
	<li>1x PBS を右心室に 3 mL 注射器で注入し、肺は完全に薄いに赤みを帯びた色からターンまで肺灌一定の吸引、排水ソリューションを削除します。</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡イメージングと肺植民地化腫瘍細胞の解析
<ol><li>胸腔内から今薄い肺を取り外し、外科はさみ鉗子24と気管と結合組織の靭帯の切除によって 5 つの葉。</li>
	<li>肺葉の配置の 2 つの棒の間にスペースを持つ網状テクスチャーを生成する担架のような肺ホルダーに示すよう図 3 bにナイロン縫合糸を巻き約二本の金属棒を用意します。6 cm 皿肺ホルダーをセットします。 注: 肺ホルダーは、共焦点顕微鏡の対物レンズの下に肺葉を安定させるために使用されます。</li>
	<li>ロッジ、肺ホルダーの網状組織、肺葉を修正します。1x PBS で肺葉を湿らすし、カバーします。</li>
	<li>件名記録肺植民地化腫瘍細胞蛍光画像をキャプチャする共焦点顕微鏡に肺のホルダーに肺葉をかくまっている 6 cm 培養皿です。</li>
	<li>イメージングのための対物レンズを使用して、(5 X、MPLN、NA: 0.1、WD: 20、空気)。</li>
	<li>NIBA (励起/蛍光; 470-495 nm/510-550 nm) にフィルター ホイールを回転、488 nm レーザーを使って、エキサイト CFSE 明らかに肺の葉に蛍光ドットのイメージを視覚化します。</li>
	<li>(マイタイ HP DeepSee レーザー) のフィルター ホイール R690 を回転 2.0 でスキャンする μ s/ピクセル スキャン速度し、HV、ゲインとオフセットを最適化レベル。</li>
	<li>10 で顕微鏡のソフトウェアを使用して蛍光画像 (512 × 512 ピクセル) をキャプチャ μ s/ピクセル スキャン速度。</li>
	<li>定量化し、前述21として ImageJ とグラフパッド ソフトウェアを用いた顕微鏡画像の統計的な分析します。</li>
</ol>6. 長期的な肺の植民地化の試金
メモ: 手順 4.1 4.5 から繰り返します。
<ol><li>4-5 週間の腫瘍細胞接種後マウスを犠牲にし、1 ~ 2 日間ブアン液25彼らの肺を修正します。</li>
	<li>定量化し、統計的に分析ソフトウェア21マウス肺から腫瘍結節。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

一緒に長期間肺植民地化アッセイ、短期的には遠く離れた臓器に Ctc によって肺菌を体内を用いてここで我々 の方法論は明確に発表し、植民地化で Ctc に組み立てられた polyFN の特定の役割を区別肺の血管外漏出と転移プロセス18,19,20,21につながった。直接確認できなかった長期の細胞追跡 CFSE 肺灌流前まで 3 日間静脈内注入の Ctc をトレースし、定量的な目的のために十分な緑の蛍光性を保持することができましたと細胞をラベルが腫瘍細胞が血管内腔内に位置していたかはすでにに血管からバリウムしました。この問題、赤い蛍光を解決するためにローダミン標識デキストラン レクチンの内皮細胞に発現する非具体的バインドすることができるが肺灌流28,29...

転移癌死1,2の主要な原因であります。主な組織由来腫瘍細胞懸濁液の循環を入力し、彼らの前に様々 な血行性課題、例えばアノイーキス、免疫の攻撃および血圧や幾何学的な制約からせん断応力に起因する損害を生き残る遠隔臓器転移3,4,5,6の成功を口述の重要なステップを植民地化することができます。そのため、積極的な努力は現在循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付けると腫瘍悪性度、転移、がん患者7,8の生存率とこれらの特性を関連付けることで行われています。,9. がん転移のプロセスは特に体内イベントを示しています、動物モデルは転移10、11,12 の完全全身プロセスをキャプチャする唯一の方法.
CTCs 遠隔臓器1,2の植民地化を含む複数の携帯電話イベントを介して転移腫瘍組織になります。ただし、最も一般的に使用される転移アッセイ13,14,15は遠隔臓器の CTC を植民地化を観察する方法を行いません。したがって、CTC の植民地化の可視化のため体内の分析設計が急務します。いくつか体内と体外の短い用語肺植民地化の試金に設計されている、問題および不利な点のまま。例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をしながらの試金の過剰発現の腫瘍細胞は、これらに使用されている22,23, 安定 transfect し、十分な GFP の蛍光強度の下で腫瘍細胞クローンの作成にかかる時間顕微鏡。同様が長期細胞トレーサー CFSE による腫瘍細胞の一時的な染色は、gfp 発現する腫瘍細胞を置き換えるに雇われている、それは CFSE 分類された腫瘍細胞が接続されているかどうかを判断することは困難または内だけに存在します摘出臓器16,17の血管。
批判的に転移腫瘍組織18,19,20,21,22 の最終的な確立に貢献する高分子フィブロネクチン (polyFN) Ctc の表面上で組み立てが見つかりました.ここでは、短期的には肺の植民地化の試金が中断されたルイス肺癌細胞 (Llc) 安定 FN shRNA (shFN) またはスクランブル shRNA (shScr) を表現し、事前の付いた CFSE c57bl/6 マウスに静脈内接種を行った。2 〜 3 日後マウス肺最初灌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 受ける前に血管内の未接続の Ctc を完全に削除する共焦点顕微鏡と肺をくわえて Llc の定量化します。明確に示した肺植民地化 shFN Llc の数と腫瘍結節はあった shScr Llc、実質的に植民地化の Ctc の成長を促進する上で Ctc で polyFN アセンブリの役割を裏付けると比較して大幅に削減、肺。我々 の研究は癌転移における polyFN の役割の検討をさらに保証します。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;(BSA)</td><td>Cyrusbioscience (台北、台湾)</td><td>101-9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's Fluid</td><td>MCC(医療化学法人)/POISON</td><td>456-A-1GL</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation Dye</td><td>ebiosciences</td><td>65-0850-85</td><td>フルネーム: カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM)&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>Cyrusbioscience(台湾、台北)</td><td>101-6381-92-6</td><td>調製したトリプシン-EDTA溶液用( 最終濃度:0.53mM )&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)(</td><td>Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lewis lung carcinoma (LLC)</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, USP&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>21051-024</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Cyrusbioscience (台北、台湾)</td><td>101-7447-40-7</td><td>調製された 1X PBS ( 最終濃度: 2.7mM )</td></tr> <tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td> <td>Cyrusbioscience (台北、台湾)</td><td>101-7778-77-0</td><td>調製された 1X PBS ( 最終濃度: 1.8mM )</td></tr> <tr><td>ナトリウム塩化物 (NaCl)</td><td>Cyrusbioscience (台北、台湾)</td><td>101-7647-14-5</td><td>調製済み 1X PBS ( 最終濃度: 137mM )</td></tr> <tr><td>リン酸二塩基性 (Na2HPO4)</td> <td>Cyrusbioscience (台北、台湾)</td><td>101-10039-32-4</td><td>調製済み 1X PBS ( 最終濃度: 10mM )</td></tr> <tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.5 g 100 mL 1X PBS</td></tr> <tr><td>と混合トリプシン</td><td>シグマAldrich</td><td>T4799</td>調製<td>されたトリプシン-EDTA溶液用(最終濃度:5g / L)</td></tr><tr><td>ゾレチル50</td>ビル<td>バック</td><td></td><td>1X PBSで希釈する&nbsp;</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンパクト卓上遠心分離機 2420</td><td>KUBOTA Co.</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>培養皿 (6cm)</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>705001</tr><tr><td>使い捨てシリンジ(針付き)</td><td>パーフェクトメディカル工業株式会社</td><td></td><td>24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml</td></tr><tr><td>エンドオーバーエンドミキサー</td><td>C.T.I YOUNG CHENN</td><td>TS-20</td><td>懸濁細胞回収用&nbsp;</td></tr><tr><td>FACSCalibur (FACS)</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dimeda</td><td>10.102.14</td><td></td></tr><tr><td>Forma Direct Heat CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>HEPA CLASS 100</td><td></td></tr><tr><td>マウス拘束具 (円筒形拘束具 15-30 gm)</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>多光子共焦点顕微鏡 BX61WI</td><td>オリンパス</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー計数室</td><td>マリエンフェルト・スペリオル</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Dimeda</td><td>08.370.11</td><td></td></tr><tr><td>手術用縫合糸&nbsp;</td><td>UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. (株)</td><td>NO. 0034</td><td>黒編み絹 非吸収性 (25YD; U.S.P. 4/0)</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>615001</tr><tr><td>15 mL Greiner</td><td>チューブ Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr></tbody></table>

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

転移は癌死の主要な原因です。血中循環がん細胞 (Ctc) Ctc によって肺を植民地化が非常に初期の肺転移過程に貢献、がん転移を促進する上での役割を積極的に検討されている.そのため、動物モデルが完全全身転移プロセスをキャプチャする唯一の方法です。体内の肺植民地化アッセイを設けて血管漏出する Ctc の貢献を調べるため実験的デザインの以前に問題が発生したことを考える長期的蛍光セル-トレーサー、carboxyfluoresceinサクシニミジルエステル (CFSE) が中断された腫瘍細胞をラベルに使用した、閉じ込められた Ctc 以外特に肺の除去、共焦点イメージングと定量前をクリアする肺灌流を行った。CTC 表面組み立てられた高分子フィブロネクチン (polyFN) は、転移性腫瘍組織の最終的な確立で肺を植民地化を仲介する発見されています。ここでは、特に肺の植民地化および血管外漏出の Ctc で polyFN アセンブリの要件をテストするため短期を行った肺植民地化アッセイを中断ルイス肺癌細胞 (Llc) (shFN) の FN-shRNA を安定に発現するかスクランブル shRNA (shScr) と 20 の前にラベルが付いた CFSE の μ M は c57bl/6 マウスに静脈内接種しました。マウス肺を植民地化する shFN LLC 細胞の能力は shScr LLC 細胞と比較すると大幅減少したことを実証します。したがって、この短期的な方法論が広く適用特に肺を植民地化する循環内で Ctc の能力を発揮する可能性があります。

体内の肺の植民地化分析を実行する前に肺の植民地化および/または転移を促進する管外中断された腫瘍細胞上の polyFN を仲介するかどうかをテストするのには、図 1 aに示されているように我々 まず滴定別CFSE は細胞透過性と共有抱合体細胞内アミン含有分子26,27中断された腫瘍細胞のと時間のかなり長い期間、細胞のままである蛍光化合物の濃度。その腫瘍細胞が効果的にラベルの付いた CFSE に示す図 1 bとしての用量依存的にわかった。6 CFSE 分類5 LLC 細胞/ml として 20 μ M の高原に達してほぼ x10 は図 1に示します。
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

血中循環がん細胞 (Ctc) がん転移中に肺を植民地化を促進する上での役割を解読する動物モデルです。ここでは、私たちが設立され、正常に実行体内法を具体的にテスト肺植民地化の Ctc の高分子フィブロネクチン (polyFN) アセンブリの要件。

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

この方法は、がん転移の達成における肺のコロニー形成の役割に関するがん転移分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、がんの転移中に早期に血管外に放出されたがん細胞を肺で視覚化できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるCheng-Han Yangです。腫瘍細胞培養が70〜80%のコンフルエントに達したら、1回の洗浄につき2ミリリットルの滅菌PBSで培養物を2回洗浄し、0.5%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを培養皿に加えます。直ちに800マイクロリットルの上清を取り除き、細胞の大部分がプレートから分離するまで、培養皿を摂氏37度に30〜60秒間置きます。10%FBSを添加した1ミリリットルの新鮮な培地を加えて反応を停止させ、1000マイクロリットルのピペットを使用して細胞溶液を激しく混合します。得られたシングルセル懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により細胞を回収します。次に、腫瘍細胞ペレットを20%FBSを添加した1.5ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞を摂氏37度で2時間回転させます。インキュベーションの終了時に、トリパンブルー排除法で生細胞をカウントし、遠心分離によりそれらを回収します。2回目の遠心分離のためにペレットを1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁し、10%FBSと20マイクロミリリットルのCFSEを添加した500マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。暗所で摂氏37度で10分後、細胞を遠心分離し、別の遠心分離のために1パーセントのFBSを補充した4ミリリットルの培地にペレットを再懸濁します。最後の洗浄後、FBS濃度を含まない新鮮な培地のミリリットルあたり5倍から6番目の腫瘍細胞に細胞を再懸濁し、細胞を氷上に置きます。次に、4〜6週齢の雄C570 Black Sixマウスの尾部を5〜10分間温めて尾静脈を拡張し、26.5ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで細胞を完全に混合します。シリンジに200マイクロリットルの細胞を慎重にロードし、マウスを拘束具に入れます。次に、拡張した尾静脈の内腔に細胞の全体積を注入します。適切な注射後の時点で、腹部から胸部まで縦方向の皮膚と皮下組織を切開し、胸膜腔を開いて心臓と肺を露出させます。滅菌外科用縫合糸を使用して、上大静脈と下大静脈を結紮して滲出液の逆流を防ぎ、ハサミを使用して左心室に2〜4ミリメートルの亀裂を作り、肺からの灌流液の排出を促進します。次に、3ミリリットルの注射器を使用してPBSを右心室に注入し、肺が赤みがかった色から完全に青白くなるまで、連続吸引を使用して排出された溶液を取り除きます。肺の灌流を成功させるために、上大静脈と下大静脈を適切に固定するように注意してください。肺を採取した後、葉を6センチの皿のカスタムメイドの肺ホルダーに入れ、肺をホルダーの網目状のテクスチャに固定します。ローブをPBSで覆って湿らせ、培養皿を共焦点顕微鏡のイメージングステージに置きます。5倍対物レンズを選択し、フィルターホイールをNIBAに回転させます。488ナノメートルのレーザーを使用してCFSEを励起し、肺葉内の蛍光青色で標識された腫瘍細胞を鮮明に視覚化できるようにします。フィルターホイールをR690に回転させて、ピクセルあたり2マイクロ秒のスキャン速度でスキャンし、高電圧ゲインとオフセットレベルを最適化します。次に、1ピクセルあたり10マイクロ秒のスキャン速度を使用して、5つの12×5の12ピクセル蛍光画像をキャプチャします。今示した染色法を使用して、腫瘍細胞は用量依存的な方法でCFSEで効果的に標識されます。標識の蛍光強度により、20マイクロモルの濃度で1ミリリットルあたり5番目のルイス肺癌細胞の6倍でほぼプラトーに達します。ちょうど示したように、収穫前の肺灌流は、画像分析の前に非特異的に切り刻まれた循環腫瘍細胞の肺血管系をクリアします。蛍光共焦点顕微鏡法は、採取および灌流された肺葉内にコロニー形成CFSE標識腫瘍細胞の存在を明らかにします。適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して蛍光画像を白黒に変換すると、肺のコロニー形成の定量化が容易になります。ルイス肺がん細胞を発現するフィブロネクチンを発現するフィブロネクチンまたはスクランブルフィブロネクチンを静脈内送達すると、注射後38時間および45時間後に採取された肺組織中のフィブロネクチン発現細胞の数が有意に減少し、肺葉のコロニー形成と腫瘍の発生におけるフィブロネクチンの役割が強調されています。この手順を試みるときは、付着していない細胞を洗い流すことができるように、肺を慎重に灌流することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、がん転移の分野の研究者がマウスゼログラムモデルで腫瘍細胞を循環させることにより肺のコロニー形成を探求する道を開きました。このビデオを見れば、腫瘍細胞懸濁液を蛍光標識する方法、腫瘍細胞を静脈内接種してマウスの肺を灌流する方法、共焦点蛍光顕微鏡を使用して転移した腫瘍細胞を画像化する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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