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蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) は、近距離の生化学的な相互作用を調査するために使用する現象です。フレットのドナー蓄光分子非放射活性を転送できますエネルギー受容体分子にそれぞれ排出量と吸光度スペクトルが重なっている場合。転送されたエネルギーの量 — とサンプルの全体的な放出したがって — 蓄光分子のドナー-アクセプタ対の近さによって異なります。フレットの解析はこれから生体分子構造と相互作用の詳細な情報を取得するその他の生化学の手法を組み合わせて “ 分光ルーラー。 ”
このビデオの原則と FRET 解析の概念をカバー。手順は、フレットとの方法を提示し、データを解釈するためのサンプルの準備について説明します。最後に、セルまたは蛋白質、蛋白質の構造を変える酵素反応の監視の部分のラベル化による構造と細胞のプロセスを監視するアプリケーションが含まれます、セルによって表される単量体の集合を監視するフレットを使用します
。蛍光共鳴エネルギー移動、またはフレット、近距離の生化学的な相互作用を調査するために用いられます。フレットは 10 内蛍光分子の間隔が場合にのみ発生しますお互いの nm。フレットの分析は、詳細な構造情報を取得する他の手法と組み合わせることができます。このビデオがフレットの基本原則を紹介、プロトコルおよびデータのプレゼンテーションを要約し、いくつかの生化学的応用を議論
。A 蓄光分子を蛍光体などの吸収スペクトルの波長の電磁波を吸収することによって興奮しています。それが緩和、その発光スペクトルの波長の光を出力します。蛍光の詳細については、参照してくださいゼウス ' s 蛍光顕微鏡ビデオ。異なる蛍光物質を吸収し、頻繁に重複する別の波長の光を発する。別蛍光体の吸収スペクトルと、蛍光体の発光スペクトルが大幅に重なっている場合、“ ドナー ” によって吸収される仮想光子をリリース、“ 受容体 ”。興奮してドナーがある 10 nm アクセプター、エネルギーのドナーからアクセプターに双極子-双極子相互作用によって転送されます。ドナーから光の放射によるエネルギーの放出はそれに応じて低下します。一方、興奮の受容体はその発光波長で発光します。フレットの応答は、効率、または蛍光または放射の他のプロセスではなくフレットによってドナーから放出されるエネルギーの割合の面で評価されます。効率は、ドナーとアクセプターとして機能するフレットを可能にする間の距離に強く依存する ' 分子 ' または ' 分光 ' ルーラー
。生化学、フレット用いられる質的彼らは互いのフレット範囲外移動と fluorophores を監視することによって分子構造変化を観察します。同様に、フレットのペアを含む分子と細胞機能を学ぶことができます。ラベル付きの分子は酵素活性、フレット停止し観察される蛍光の波長変化によって切断されかどうか
。フレットの背後にある原理を理解することができます ' プロトコルと提示し、データを解釈するいくつかの方法の概要を見て
。前に実験、関心、DNA やタンパク質の生体蛍光タグで分子生物学手法修正を導入する一般的な方法を使用して工作。細胞に遺伝物質は、トランスフェクション、エレクトロポレーション
。、セルが例えば蛍光顕微鏡でフレット可視化の準備、分子が 1 分子 FRET のスライドに固定化される可能性がありますまたはサンプルは、高スループット スクリーニングのための井戸に読み込まれます
。、励起レーザー、顕微鏡および関連機器用意しています。(A) フレット実験は度々 強力なレーザー。(B) 適切な PPE と安全手順を使用する必要がありますサンプルは楽器に配置し励起レーザー点灯。
。実験細胞の挙動を監視、カラー画像表示の違いまたは発光強度の変化は使用されます。ドナーとアクセプターの発光強度をプロット一緒に時間をかけてフレット応答を追跡するため
。フレット データより複雑な分析のためのさまざまな機能に合うことができます。によって実験データが提示されて最高を表す複数の方法で柔軟な実験ツールをフレットを作る結果
。今あなた ' 実行とフレット実験の分析の基礎を使い慣れてみましょう ' 生化学研究でフレットのいくつかのアプリケーションを見て
。フレットは、タンパク質や細胞の 10 の内で移動すると予測の部分のラベル化による構造変化や細胞プロセスを研究するため使用ことができますフレット ペアでお互いの nm。たとえば、タンパク質センサーは、fluorophores のペアを持つ受容体の分類によって準備されます。フレットの応答は、共焦点顕微鏡によるライブ監視されます。発光波長と強度の変化を示す変化
。フレットは、アクティブなフレットのペアを持つ分子の準備および応答の変化を観察することによっても使用できます。基板を切断すると、排出量ドナーとアクセプター発光の減少の増加を引き起こしてフレットが中断されます。排出量は、ドナー、アクセプタ、フレットによっての貢献を決定するために分析されます。シアンと黄色蛍光タンパク質の直接排出係数が計算されると、濃度と基板の速度論的パラメーターを決定できます
。セルがフレットのペアは、その関数のいずれかを含むモノマーを表現する設計されて ' センサー ' これらの単量体間の相互作用のため。これらのモノマーの凝集を誘起すると、フレットの応答が観察されます。これを使用してによって引き起こされる蛋白質の集合を調査することができます ' シード ' タンパク質。セルされた名所抱卵し、フローサイトメトリーによる解析蛋白質の集合体増殖型、ここ
。あなた ' ve を見たゼウス ' s 蛍光共鳴エネルギー移動、またはフレットのビデオ。このビデオは、フレット、準備、フレットの実験、およびいくつかの生化学的アプリケーションの解析の基本原則を含まれている
。見てくれてありがとう!
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、近距離の生化学的相互作用を調査するために使用される現象です。FRETでは、ドナーフォトルミネッセンス分子は、それぞれの発光スペクトルと吸光度スペクトルが重なれば、非放射的にエネルギーをアクセプター分子に伝達することができます。伝達されるエネルギーの量、ひいてはサンプルの全体的な放出は、フォトルミネッセンス分子のアクセプター-ドナーペアの近接性に依存します。FRET分析は、他の生化学技術と組み合わせて、この「分光定規」から生体分子の構造と相互作用の詳細な情報を取得します。
このビデオでは、FRET解析の原理と概念について説明します。この手順では、FRETのサンプルの準備と、データの表示と解釈の方法に焦点を当てています。最後に、アプリケーションには、細胞またはタンパク質の一部を標識することによるコンフォメーションおよび細胞プロセスのモニタリング、タンパク質構造を変化させる酵素反応のモニタリング、およびFRETを使用した細胞によって発現されるモノマーの凝集のモニタリングが含まれます。
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、発光分子間のエネルギーの非放射移動であり、近距離の生化学的相互作用の研究によく使用されます。FRETは、蛍光分子が互いに10 nm以内に間隔を空けている場合にのみ発生します。FRET解析は、他の手法と組み合わせて、詳細な構造情報を取得できます。このビデオでは、FRETの基本原理を紹介し、プロトコルとデータプレゼンテーションを要約し、いくつかの生化学的アプリケーションについて説明します。
蛍光色素分子のようなフォトルミネッセンス分子は、その吸収スペクトルの波長で電磁放射を吸収することによって励起されます。弛緩すると、発光スペクトル内の波長で光を放出します。蛍光の詳細については、JoVEの蛍光顕微鏡に関するビデオをご覧ください。異なる蛍光色素分子は、異なる波長の光を吸収および放出し、それらは頻繁に重なります。蛍光色素分子の発光スペクトルが別の蛍光色素分子の吸収スペクトルと大幅に重なる場合、「ドナー」は仮想光子を放出し、これは「アクセプター」によって吸収されます。励起されたドナーがアクセプターから10 nm以内にある場合、エネルギーは双極子-双極子相互作用によってドナーからアクセプターに伝達されます。ドナーからの光の放出によるエネルギーの放出は、それに応じて減少します。一方、励起されたアクセプターは、その発光波長で光を放出します。FRET応答は、効率、または蛍光やその他の放射プロセスではなくFRETによってドナーから放出されるエネルギーの割合の観点から評価されます。効率はドナーとアクセプターの間の距離に強く依存するため、FRETは「分子」または「分光」の定規として機能することができます。
生化学では、FRETは、蛍光色素が互いのFRET範囲に出入りする際の蛍光色素分子のコンフォメーション変化を観察するために定性的に使用されることがよくあります。同様に、細胞の機能は、FRETペアを含む分子で研究できます。標識された分子が酵素活性によって切断されると、FRETは停止し、観察された蛍光波長が変化します。
FRETの背後にある原理を理解したところで、プロトコルの概要と、データを表示および解釈するいくつかの方法を見てみましょう。
実験に先立ち、目的の生体分子(通常はDNAまたはタンパク質)を、分子生物学的手法を用いて蛍光タグで操作します。修飾された遺伝物質を細胞に導入する一般的な方法には、トランスフェクションやエレクトロポレーションなどがあります。
次に、細胞を蛍光顕微鏡でFRETの可視化のために準備します。例えば、分子をスライド上に固定化して単一分子のFRETにしたり、サンプルをウェルにロードしてハイスループットスクリーニングを行ったりします。
次に、励起レーザー、顕微鏡、および関連機器を準備します。(A)FRET実験には、多くの場合、強力なレーザーが含まれます。次に、サンプルを装置に入れ、励起レーザーで照射します。
細胞の挙動をモニタリングする実験では、発光強度の違いや変化を示すカラー画像を使用します。ドナーとアクセプターの放出強度を一緒にプロットして、FRETの応答を経時的に追跡します。
FRETデータは、より複雑な分析のためにさまざまな機能に適合させることもできます。実験によっては、結果を最もよく表すためにデータを複数の方法で提示できるため、FRETは柔軟な実験ツールになります。
FRET実験の実行と分析の基本を理解したところで、生化学研究におけるFRETのいくつかのアプリケーションを見てみましょう。
FRETは、互いに10 nm以内に移動すると予測されるタンパク質または細胞の一部をFRETペアで標識することにより、コンフォメーション変化または細胞プロセスを研究するために使用できます。例えば、タンパク質センサーは、一対の蛍光色素で受容体を標識することによって調製されます。FRET応答は、共焦点顕微鏡によってライブで監視されます。発光波長と発光強度の変動は、立体配座の変化を示しています。
FRETは、活性FRETペアを持つ分子を調製し、応答の変化を観察することによっても使用できます。基板が切断されると、FRETが破壊され、ドナー放出が増加し、アクセプター放出が減少します。排出量は、ドナー、アクセプター、およびFRETによる貢献を決定するために分析されます。シアン色および黄色の蛍光タンパク質の直接発光係数が計算されると、基質の濃度および速度論的パラメータを決定できます。
FRETペアのいずれかを含むモノマーを発現するように設計された細胞は、それらのモノマー間の相互作用の「センサー」として機能します。これらのモノマーの凝集が誘導されると、FRET応答が観察されます。これは、誤って折りたたまれたタンパク質の「播種」によって引き起こされるタンパク質凝集を調査するために使用できます。ここでは、細胞に目的のタンパク質の凝集体を形質導入し、インキュベートし、フローサイトメトリーで分析しました。
JoVEのFörster Resonance Energy Transfer(FRET)に関するビデオをご覧になりました。このビデオには、FRETの基本原理、FRET実験の準備と分析、およびいくつかの生化学的アプリケーションが含まれていました。
ご覧いただきありがとうございます!
FRETは、発光分子間のエネルギーの非放射移動であり、近距離の生化学的相互作用を調査するためによく使用されます。FRETは、蛍光分子が互いに10 nm以内に間隔を空けている場合にのみ発生します。FRET解析は、他の手法と組み合わせて、詳細な構造情報を取得できます。このビデオでは、FRETの基本原理を紹介し、プロトコルとデータプレゼンテーションを要約し、いくつかの生化学的アプリケーションについて説明します。
蛍光色素分子のようなフォトルミネッセンス分子は、その吸収スペクトルの波長で電磁放射を吸収することによって励起されます。弛緩すると、発光スペクトル内の波長で光を放出します。蛍光の詳細については、JoVEの蛍光顕微鏡に関するビデオをご覧ください。異なる蛍光色素分子は、異なる波長の光を吸収および放出し、それらは頻繁に重なります。蛍光色素分子の発光スペクトルが別の蛍光色素分子の吸収スペクトルと大幅に重なる場合、「ドナー」?仮想光子を放出し、これは「アクセプター」によって吸収されます。励起されたドナーがアクセプターから10 nm以内にある場合、エネルギーは双極子-双極子相互作用によってドナーからアクセプターに伝達されます。ドナーからの光の放出によるエネルギーの放出は、それに応じて減少します。一方、励起されたアクセプターは、その発光波長で光を放出します。FRET応答は、効率、または蛍光やその他の放射プロセスではなくFRETによってドナーから放出されるエネルギーの割合の観点から評価されます。効率はドナーとアクセプターの間の距離に強く依存するため、FRETは「分子」または「分光」の定規として機能することができます。
生化学では、FRETは、蛍光色素が互いのFRET範囲に出入りする際の蛍光色素分子のコンフォメーション変化を観察するために定性的に使用されることがよくあります。同様に、細胞の機能は、FRETペアを含む分子で研究できます。標識された分子が酵素活性によって切断されると、FRETは停止し、観察された蛍光波長が変化します。
FRETの背後にある原理を理解したところで、プロトコルの概要と、データを表示および解釈するいくつかの方法を見てみましょう。
実験に先立ち、目的の生体分子(通常はDNAまたはタンパク質)を、分子生物学的手法を使用して蛍光タグで操作します。改変された遺伝物質を細胞に導入する一般的な方法には、トランスフェクションとエレクトロポレーションが含まれます。
次に、細胞を蛍光顕微鏡でFRET視覚化するために準備します。例えば、分子をスライド上に固定化して単一分子FRETにしたり、サンプルをウェルにロードしてハイスループットスクリーニングを行ったりします。
次に、励起レーザー、顕微鏡、および関連機器を準備します。(A)FRET実験には、多くの場合、強力なレーザーが含まれます。(B)したがって、適切なPPEと安全手順を使用する必要があります。?次に、サンプルを装置に入れ、励起レーザーで照らします。
細胞の挙動をモニタリングする実験では、発光強度の違いや変化を示すカラー画像を使用します。ドナーとアクセプターの放出強度を一緒にプロットして、FRETの応答を経時的に追跡します。
FRETデータは、より複雑な分析のためにさまざまな機能に適合させることもできます。実験によっては、結果を最もよく表すためにデータを複数の方法で提示できるため、FRETは柔軟な実験ツールになります。
FRET実験の実行と分析の基本を理解したところで、生化学研究におけるFRETのいくつかのアプリケーションを見てみましょう。
FRETは、互いに10 nm以内に移動すると予測されるタンパク質または細胞の一部をFRETペアで標識することにより、コンフォメーション変化または細胞プロセスを研究するために使用できます。例えば、タンパク質センサーは、一対の蛍光色素で受容体を標識することによって調製されます。FRET応答は、共焦点顕微鏡によってライブで監視されます。発光波長と発光強度の変動は、立体配座の変化を示しています。
FRETは、活性FRETペアを持つ分子を調製し、応答の変化を観察することによっても使用できます。基板が切断されると、FRETが破壊され、ドナー放出が増加し、アクセプター放出が減少します。排出量は、ドナー、アクセプター、およびFRETによる貢献を決定するために分析されます。シアン色および黄色の蛍光タンパク質の直接発光係数が計算されると、基質の濃度および速度論的パラメータを決定できます。
FRETペアのいずれかを含むモノマーを発現するように設計された細胞は、それらのモノマー間の相互作用の「センサー」として機能します。これらのモノマーの凝集が誘導されると、FRET応答が観察されます。これは、誤って折りたたまれたタンパク質の「播種」によって引き起こされるタンパク質凝集を調査するために使用できます。ここでは、細胞に目的のタンパク質の凝集体を形質導入し、インキュベートし、フローサイトメトリーで分析しました。
JoVEのF?rster Resonance Energy Transfer(FRET)に関するビデオをご覧になりました。このビデオには、FRETの基本原理、FRET実験の準備と分析、およびいくつかの生化学的アプリケーションが含まれていました。
ご覧いただきありがとうございます!
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