放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

このプロトコルの全体的な目標は、イメージングを介して生きたげっ歯類の腫瘍の成長と転移を追跡することです。放射性核種蛍光融合レポーターは、陽電子放出断層撮影法による非侵襲的なin vivo検出を可能にし、蛍光色素による結果の確認を支援します。この方法は、生きた動物で細胞を長期間追跡する必要がある場合に、重要な質問に答えるのに役立ちます。

これは、遠隔転移の理解と腫瘍の進行に対する治療の影響の理解に貢献できます。記載されている技術は、自動合成によって生成されたPETトレーサーを使用した高感度で非侵襲的なin vivoイメージングによる癌細胞の追跡です。従来の方法と比較して、動物の使用を大幅に削減できます。

この方法に不慣れな人は、その複雑さに圧倒されるかもしれません。特に、PET放射性トレーサーの自動合成により、このプロセスが大幅に簡素化されます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、重要なイメージング関連ステップのこれらのビューを示していると考えています。

この技術の意味するところは、がん細胞と一緒に追跡できる新しい治療法の前臨床試験にも及びます。この方法は、がんの生物学と治療法の開発に関する洞察を提供することができます。特定の集団のin vivoローカリゼーション、再配置、拡大、および長期モニタリングが関心を持つときはいつでも。

まず、レポーター遺伝子プラスミドを使用し、レンチウイルス粒子を作製し、細胞を形質導入し、それらを特徴付けます。次に、NISFP発現細胞株における放射性トレーサーの取り込みにより、レポーター遺伝子の機能を解析します。精製した細胞と増殖培地を6つのウェルプレートに播種し、すべてのサンプルが三重に調製されていることを確認します。

翌朝、細胞を無血清増殖培地で洗浄し、50キロベクレルのF18テトラフルオロホウ酸塩とプレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、上清を収集し、100マイクロリットルを事前に標識された収集チューブに移します。残りの上清を捨ててから、カルシウムとマグネシウムを生理学的レベルで含む1ミリリットルの氷冷PVSで細胞を洗浄します。

洗浄液を回収し、100マイクロリットルの洗浄液を標識済みの採取チューブに移します。その後、もう一度洗浄プロセスを繰り返します。トリプシンとEDTAの両方を含む500マイクロリットルのPVSを加えて、細胞を持ち上げます。

細胞が剥離するまで試料を摂氏37度でインキュベートし、顕微鏡を使用して剥離を確認します。次に、細胞懸濁液を標識された収集チューブに移します。次に、細胞サンプルを250 Gで摂氏4度で4分間遠心分離します。

自動ガンマカウンターを使用して、4つのサンプルタイプのそれぞれからサンプルをカウントし、式1を使用して取り込み率を取得します。F18テトラフルオロホウ酸塩の合成を開始するには、自動無線合成プラットフォームを適切なケミカルフードにセットアップし、正しいXMLファイルが制御コンピューターにロードされていることを確認します。シンセサイザーが作動している間、F18テトラフオロボレートが生成され、アニオン交換カートリッジで精製されます。

陰イオン交換カートリッジは水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させます。最終製品は、1ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムを含む陰イオン交換カートリッジから言及され、出口ラインを介してガラス収集バイアルに移されます。イメージングを開始するには、書かれたプロトコルに従ってマウスを麻酔し、準備します。

次に、滅菌済みの0.9%生理食塩水を使用して、F18テトラフルオロホウ酸溶液を50マイクロリットルあたり5メガベクレルに希釈します。皮下注射針付きのシリンジを使用して、F18テトラフルオロホウ酸溶液を100マイクロリットル引き出します。.シリンジ内の放射能を測定し、値と測定時間を記録します。

50マイクロリットルのF18テトラフルオロホウ酸溶液を、事前に温めた尾部に静脈内投与します。.次に、シリンジ内の残留放射能を測定し、測定の値と時間を記録します。放射性トレーサーの尾静脈注射は重要です。

動物麻酔下で行い、誤注入や放射性トレーサーの流出のリスクを最小限に抑えます。動物は、PET画像取得の開始まで麻酔下に置かれます。放射性トレーサー注射の正確な45分後。

次に、タイマーを45分からカウントダウンするように設定し、マウスがテーブル上の胸骨の位置に配置されていることを確認します。適切な外科用モニタリング機器を設置し、機器が適切に機能していることを確認してください。次に、CTイメージングとPET画像取得のパラメータを設定します。

カウントダウンタイマーが15分を読み取りたらCT画像取得を開始し、タイマーが0分を読み取りたらPET画像取得を開始します。まず、安楽死させたマウス全体の放射能を測定し、測定の値と時間を記録します。次に、マウスを解剖し、必要な組織を採取します。

尾の有無にかかわらず、残りの死骸の放射能を測定します。これらの値を記録し、測定時間をメモします。次に、採取したすべての組織を個別に秤量し、日光下および蛍光光の下で癌性臓器の写真を撮ります。

次に、下流の組織型検査のために組織をOCTに埋め込みます。採取したすべての組織の放射能を測定し、値を記録し、測定時間を記録します。最後に、式 2 に示すように、データを標準取り込み値または SUV として提示します。

この実験では、放射性核種蛍光レコーダー遺伝子イメージングを使用して、げっ歯類腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡しました。共焦点蛍光顕微鏡法により、NISFPの正確な原形質膜局在が実証されました。NISFPの機能と特異性は、NISが提供する放射性トレーサーの取り込みを使用して定量化されました。

4T1NISGFPと4T1NISRFPを発現する細胞株との間には、NIS発現レベルが類似している有意差は認められませんでした。重要なことに、プレクロレートブロックは、得られた放射性トレーサーの取り込みが特定のNISFP発現によるものであることをすべての細胞株で示しました。担がん動物の全身PETイメージングにより、腫瘍の進行と転移拡大に関する情報が明らかになりました。

ここに示す例は、肺にいくつかの異なる結節を伴う広範な長期転移を示しています。注入された線量値の割合と肺の個々の転移の占有量はさまざまでした。.ただし、体積正規化された注射用量値は同様の範囲内にありました。.

デュアルモードレポーター遺伝子の蛍光タンパク質は、動物解剖中の蛍光光下での癌組織の同定を可能にしました。その後のex vivo放射性トレーサーの生体内分布により、放射性トレーサーの取り込みが高い臓器、つまりNISを発現する組織であることが明らかになりました。甲状腺や唾液腺、そして胃はNISを先住民族に発現していますが、他のすべての陽性シグナルは腫瘍や転移などのがん組織を示しています。

放射性核種蛍光レポーターは、下流の組織切片におけるがん細胞の同定も可能にします。この技術は、がん分野の研究者が自然発生的転移のプロセスを視覚化し、薬物がそれにどのように影響するかをテストするための道を開きました。この手順を試行する際は、すべてのステップを慎重に計画することが重要です。

細胞株を樹立し、動物腫瘍モデルを設定し、イメージング用のすべての試薬と機器を必要な日に利用可能にする必要があります。まずは小規模なパイロット実験から始めることをお勧めします。一度習得すれば、放射性トレーサーの作製とin vivo動物のイメージングは、適切に行われれば、1日8時間の労働で6匹の動物で行うことができます。

このビデオを見れば、放射性核種レポーターNISと蛍光タンパク質の組み合わせを使用して、in vivo細胞追跡が可能なレポーター遺伝子にどのようにアプローチするかを十分に理解できるはずです。また、in vivoイメージングに必要なPET放射性トレーサーを作製し、in vivoおよびex vivoによる分布実験を行うために、細胞株を発現するNISFPレポーターの特性評価もできる必要があります。この手順に続いて、追加の質問に答えるために、蛍光サイトメトリーなどの他の方法を実行できます。

例えば、腫瘍の免疫細胞プロファイルとその転移が互いにどのように関連しているか、または時間の経過とともにどのように変化するかなどです。マイクロプラスミドは転帰に影響を与えると報告されているため、作製する細胞株にマイクロプラスミドが含まれていないことを確認することを忘れないでください。重要なことは、放射性同位元素の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には常に自己と他者の保護を優先する必要があることを忘れないでください。