Name: タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 学ぶ3D-PAGE法によるBrassica napus師部サップからのタンパク質・リボ核蛋白質複合体の分離と同定。BN-PAGEと変性電気泳動を組み合わせ、タンパク質と核酸成分を高分解能で解析する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

彼らの科学的なサポート、ジェニファー フェイントをかけるとウルシュラ Zarzenska に感謝します。この仕事はキャリア統合許可 (CIG、PCIG14-ジョージア州-2013-63 0734) 第 7 フレームワーク プログラム、LFF GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung ハンブルク)、グラントと DFG グラント (DFG KE 856_6-1) 内にある欧州委員会によって財政上支えられるJK に授与。

1. サンプリングやナタネから師管液の準備植物4,8,20
<ol><li>サンプリング、師部樹液植えた 8 週齢を使用してナタネ植物花粉の汚染を防ぐためにそのショーの唯一の初期開花。</li>
	<li>注射針を使用して (Ø 0.8 mm) および点状花房茎数回。いくつかの他の花房の茎と十分な師部 sap (図 2 a) を取得する他の植物を繰り返します。 メモ: 複素解析の勧め師部樹液の少なくとも 600 μ L で開始します。4 に 5 の植物師管液の 200 と 700 μ L の間になります。</li>
	<li>ろ紙を負傷したサイトから最初のドロップをふき取りなさい。これらの低下は主に負傷した組織の周囲から高汚染物質を含むし、破棄する必要があります。</li>
	<li>ピペッティングで次の滴を収集し、凍らない冷却システムを用いた-20 ° C であらかじめ冷やして円錐 1.5 mL の反応管内の収集した滲出液を格納します。</li>
	<li>さらにドロップ形成される観察可能なしかし、もはや 1 時間以上まで収集を継続します。収集した師管液の重要な損失することがなく 2 日後、この手順を繰り返すことができます。 注: 収集した師管液することができますすぐに使用または将来の分析のための-80 ° C で保存します。-80 ° C のストレージの衝撃-凍結反応チューブ液体窒素で。</li>
	<li>分子量 10,000 ダルトン (Da) のカット (MWCO) を用いた遠心コンセントレーター最初のボリュームの約 1/6thに師部サンプルを集中します。4 ° C とダスト粒子を除去する、少なくとも 15 分間 20,000 × g の集中のサンプルを遠心します。 注: 師部 sap 濃度は蛋白質の低下にはつながらない。</li>
	<li>その後の複雑な分析手順 3.1 に進みます。</li>
</ol>2. 師部 sap 純度制御逆転写 PCR (RT-PCR) 4,8,20を使用して
<ol><li>師管液液体材料の標準的な RNA 抽出法を使用してからの総 RNA の隔離 (例えばTRIzol またはフェノール-クロロホルム抽出に続いた水相洗浄手順によるとエタノールからイソプロパノールの沈殿物によって、製造元のプロトコル)。 注意: フェノール クロロホルムは有毒です。適切な個人的な保護装置のフードの下で動作します。6 ヶ月間-80 ° c のエタノールで抽出した RNA を保存できます。</li>
	<li>DNA の DNase と消化による汚染を削除私は 37 ° C で 45 分間 (1 u/μ g) EDTA を最終濃度 5 mM に追加することによって、酵素を不活性化し、75 ° C 10 分でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>純粋な RNA 浄化し、もう一歩浄化 (例えばRNA のクリーンアップ キット、製造元の指示に従ってを使用して) このサンプルを集中します。</li>
	<li>逆転写 PCR (RT-PCR) を共演 150 を使用して cDNA 合成キット cDNA の合成純粋な RNA の ng はメーカーで指定されているプロトコル 's。 注: cDNA は-20 ° C でさらに使用するまで格納できます。</li>
	<li>コンパートメント特定の成績証明書を増幅し、アガロース電気泳動でチェックにテンプレートとしての製造元によって指定された標準 PCR の反作用のための cDNA の 5 μ L を使用します。例えば rubisco 小サブユニット、チオレドキシン h、および花粉外被蛋白質 (表 1図 1 b) のプライマーを使用して篩部試料の純度を確認してください。</li>
</ol>3. 青ネイティブ ページ4,25,26,31
<ol><li>27または商業 Bis トリス グラデーション ジェルに従って別の場所でどちらかの自己注がれたネイティブ勾配ゲルを使用します。</li>
	<li>負荷のゲルのウェルあたり高濃度タンパク質サンプルの 20 に 30 μ g を少なくともトリプリケートします。</li>
	<li>4 ° C および 150 V でゲルを実行サンプル (約20 〜 30 分、図 3 a) ゲルの 1/3rdを渡されるまで、暗い青カソード バッファー B と陽極バッファー (表 2) を使用しています。 注: 北しみが付くこと、単一ゲル レーンで十分中、3 D ページおよびより少なく豊富な蛋白質を集中する最大 10 個のゲル レーンから同じバンドを組み合わせることをお勧めは質量分析によるタンパク質組成分析のためです。</li>
	<li>光青カソードと交換暗い青陰極バッファー B B/10 (表 2) をバッファーの実行や、実行を一時停止します。ゲル (ca. 120 に 180 分、図 3 a) ゲルから溶出するブルーのフロントの起動時に実行を終了します。 注: 完成した青ネイティブ ゲルは 4 ° C で少なくとも 1 週間保存できます。長期の保管はバンドをびまん性につながることができ、避けるべきであります。暗い青バッファー B は再利用できます。</li>
</ol>4. ブルー ネイティブ北しみが付く4を使用して RNA を検出するオプション:
<ol><li>明瞭なバンドをカット、ネイティブ ブルージェルから全体のゲルのレーンを使用または半乾燥する 60 分の 3.5 mA/cm2でしみが付くことによってナイロン膜にそれらを転送し、膜 (図 4 a) に鉛筆で上限と下限のゲルの境界線をマークします。</li>
	<li>ブロッティング後 DEPC 処理水の膜を洗浄し、2 つのフィルター ペーパーの乾燥します。</li>
	<li>120,000 μ J/cm2でブロッティング膜の紫外架橋を実行 (85 sテーブルの材料で、架橋剤を使用している場合)。</li>
	<li>前ハイブリダイゼーション オーブン (図 4 a) で 68 ° C で 60 分間交配バッファー (市販または自作) の 6 mL で膜を交配させます。</li>
	<li>3'-ビオチン化プローブの 4 μ L を含む交配バッファーの追加 1 mL を追加 (100 nM)。</li>
	<li>37 ° c. に 68 の ° C からオーブンを冷却しながら一晩、プローブと膜を孵化します。</li>
	<li>不特定にバインドされているプローブを削除する部屋の温度で 5 分間、2 x SSC と 0.1 %sds を格納するバッファーで膜を洗浄します。 注意: SDS は、炎症を引き起こす可能性が。SDS とソリューションを含む SDS を使用するときは、手袋、白衣を着用します。</li>
	<li>西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 基板、高感度化学発光反応 (図 4 a) の結果として、膜などストレプトアビジン-HRP-共役とルミノールの 3'-ビオチン化プローブの検出を実行します。</li>
</ol>5. 2 番目の寸法: トリス トリシン尿素ページ4,28
<ol><li>青ネイティブ ゲルから単一のバンドを切除します。さらに複雑なタンパク質 (図 5) 濃度を達成するために車線を並列で実行サンプルからバンドを結合します。 注: 摘出バンドに格納できる単一反応管 4 ° C でさらに使用するまで</li>
	<li>12% トリス トリシン尿素ゲルを注ぎなさい (厚さ 1 mm、6.8 × 8.6 cm (幅 × 長さ))。(表 2)、分離ゲルのゲル溶液の 10 mL を準備 2 つのガラス板とイソプロパノールとオーバーレイの間注ぐ。重合終了後、イソプロパノールを取り外し、ゲルと、10 もくし挿入にスタッキングのゲルのゲル液 B (表 2) の 4 つの mL。 注意: 未重合アクリルアミドは神経毒性することができます、TEMED 吸入すると有害。常に個人保護具を着用し、フードの下で働きます。</li>
	<li>1.5 mL の反応管に摘出したゲルのバンドを転送し、ゲル部分 (図 5表 2) 平衡の SDS サンプルバッファー x 2 の 1 mL を追加します。<ol>
<li>暖房のブロック (95 ° C) または電子レンジで沸騰する前に、室温で 10 分間のサンプルをインキュベートし、さらに 15 分の室温で再度サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>1 つの単一のゲルのポケットに同じ建物を表すいくつかの平衡ゲル部分をスタックします。</li>
		<li>アノードとカソード 45 ~ 60 分の 150 V でバッファーを実行するを使用して電気泳動を行い、全体のゲル レーンを消費税します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酸性バッファー (100 mM 100 mM 酢酸トリス) で 20 分間カット レーンをインキュベートし、125 mm トリス-HCl、別の 20 分 (図 5) の 6.8 pH 平衡します。</li>
</ol>6. 3 次元: SDS ページ4,32
<ol><li>塩化物イオンと32によるとゲルの分離 15 %sds を注ぐ (厚さ: 1.5 ミリメートル、6.8 × 8.6 cm (幅 × 長さ)) (表 2)、ゲル上のスタック 4% の薄い層を追加。 注意: SDS、アクリルアミド、TEMED が有毒、有害であります。フードの下で働くし、個人用保護具を着用します。</li>
	<li>SDS ゲルの平衡ゲル レーンを転送し、ブロモフェノール ブルー (図 5) の微量を添加したバッファーを実行する 1 x SDS の 0.5% (w/w) agarose のゲルをカバーします。</li>
	<li>電子レンジでの agarose が付いてのバッファーをゲルにロード前に実行中の SDS を沸騰させます。</li>
	<li>単一成分の分子量を推定するためのタンパク質マーカーを実行、agarose が固化するまで一枚のゲルの 1 つの端にフィルター紙を挿入または通常 IPG ゲルに使用されます特殊な櫛を使用します。</li>
	<li>150 V 60 分と汚れでゲルを実行コロイド Coomassie、銀染色のいずれか、またはその他のゲル染色法以降の質量分析に適した。</li>
	<li>分析のようなマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法によるアプローチを使用して目に見える蛋白スポット飛行時間 (MALDI-TOF) やクロマトグラフィー-タンデム質量質量分析法。 注: 染色としてすでに記載されている33コロイド Coomassie を使用する勧めします。私たちの手でより豊富な蛋白質十分に染色することができますを使用することができ、合理的なデータ品質の質量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01007704">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li>
<li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li>
<li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li>
<li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+Transit%3A+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li>
<li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Bio%22%5BJournal%5D)">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li>
<li>Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDinant%2C+S+%22Plant+Mineral+Nutrients%22">Plant Mineral Nutrients</a>. 953, 185-194 (2013).</li>
<li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v171/n4351/abs/171528a0.html">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528(1953).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li>
<li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution%2C+glutathione%2C+and+glutathione+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li>
<li>Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+biologies%22%5BJournal%5D)">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li>
<li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111(2013).</li>
<li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+%28Solanum+lycopersicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+%28Lupinus+albus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).</li>
<li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+%28Lupinus+albus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li>
<li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li>
<li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li>
<li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li>
<li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Rais, I., Karas, M., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+PAGE+in+plants%3A+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11(2005).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+traffic+in+the+fast+lane%3A+long-distance+signalling+by+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li>
<li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li>
<li>Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypyrimidine+tract+binding+protein%2C+pumpkin+RBP50%2C+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

師部は高利のコンパートメント、深水の主要交通ルートを構成する、別の植物の部品9,20,34、間長距離シグナル伝達に必須でも 35。小さな分子に加えてタンパク質と Rna のような高分子は師部メンテナンスとシグナリング4,7,8関与しています。師部組成の分析は、ほとんど植物の師部サンプルに限られたアクセシビリティによって制限されます。昆虫スタイレット手法は広く適用が実験的に厳しいと師部サンプル11の非常に少量の結果します。師部をサンプリングするために使用される 1 つの簡単なテクニックは、EDTA 促進溶出12です。EDTA はカルシウムのような二価イオンをキレートおよび P 蛋白質およびカロースによる篩板の閉鎖を防止すること。それは使いやすいが、損傷した細胞による汚染しやすい、サンプルを希釈します。EDTA による二価イオンの破壊も、既存の複合体の破壊に 。ただし、それはモデル植物シロイヌナズナ15を含む種の広い範囲からのサンプリングができます。師部樹液の自発的な滲出物は、植物種の小さい数でのみ発生します。植物組織10の重大な傷害を伴う侵襲的な方法です。我々 は最近の長距離輸送4,8,20を研究モデル種としてナタネを設立しました。ここで、師管液楽しめます小さな切開から負傷の影響と汚染源を軽減できます。
別のサンプリング技術を使用して、別の植物種から採取された師部のプロテオームを近年7,8,17,36,37,で検討されている38,39。これらのプロテオーム研究蛋白質で抽出、条件の変化の下で沈殿蛋白質: 蛋白質および蛋白質についての結論を許可しないため、: 核酸相互作用が原産の条件の下に存在します。Co-免疫沈降 (CoIP) とオーバーレイの試金示されるカボチャ40、師部樹液の主要なリボ核蛋白質の複雑ながありますが、内のネイティブの条件の下で任意の高分子複合体が存在することを認められなかった、師部システム。
Schäggerらによって導入された、青ネイティブ ページ26日以降高解像度ゲル電気泳動手順との組み合わせでは、大規模なタンパク質複合体の個々 のコンポーネントの分離を有効にします。ネイティブナタネの 3 D ページ解析を使用して, 篩部の滲出液が最近ことを示すいくつかの高分子量蛋白質: 蛋白質と RNP 複合体師部サンプルに存在が酵素によって実行中4。サイズ排除クロマトグラフィーのような蛋白質の複合体として結合を分離する方法は存在するが、BN ページと比較した場合は解像度の面で失敗する可能性があります。さらに、複雑な分離の合理的な品質、サイズ排除列行列は調査されている全体的な複雑な分子量に応じて対応しなければなりません。異なるサイズの複合体を分析、したがって集中的なコストは、BN ページとして高い焦点を力として可能にしない列の種類を要求します。
ナタネから複合体を分析するための重要なステップは、師管液の開始材料として使用を含めます。師部サンプルの少なくとも 600 μ L 必要し、5 つ植えた植物から得られます。3 D ページおよび BN 北しみが付くことの師部サンプルの十分な量の初期の BN ゲルを開始する必要が。これを達成するには、師部サンプル集中している蛋白質の 20 に 30 μ g は、よく、少なくともそれぞれに読み込まれることができますまで並列で実行される同じサンプルのトリプリケートします。低すぎるか高すぎる濃度を減らす複合体 (図 3) の検出。師部のサンプルは、氷の上の反応管に収集する必要があります、タンパク質分解と売り上げ高を避けるために後で使用できるフリーズされて保存されるべきであります。プロテアーゼ阻害剤は、すべて師部プロテオーム解析で発見されているが、ナタネ4の師部の完全にアクティブなプロテアソームがまた記述されていた。さらに、ボリュームと師部サンプル組成依存サンプリング時点で環境条件10。したがって同じような条件の下で一日の同じ時間で収集するためには注意が必要があります。ストレス治療 (干ばつなど) は収集できる師部の量を減らすことができます。質量分析法による単一蛋白質を識別するために、すべての時間の手袋を装着して可能なケラチン汚染を制限する必須です。ケラチンは質量スペック解析時に追加の信号につながるし、タンパク質の同定を妨げません。高電圧や周囲温度で BN ページで実行すると、壊れやすい複合体の分解が生じるゲルの加熱につながります。
ここで提示されたプロトコルは蛋白質: 蛋白質複合体の解析に適しています。また、使用と並列の複合体に含まれている特定の Rna を検出できますが.これを達成するには、最近 BN 北部4しみが付くことのためのプロトコルを導入しました。Rna は、RNAse 汚染による劣化になりやすいです。このような劣化を抑える DEPC 処理水使用してください。
本手法の主な制限は、移行動作サイズ、形状とも複合体31、翻訳後修飾によって異なりますので BN-PAGE - で区切られたタンパク質の分子量の推定 41。RNP 複合体のサイズ推定は移行挙動に及ぼす核酸が原因も複雑です。それも防止できない同じサイズの複合体は共同 1 つの単一バンドに移行。これは複雑な組成の誤った予測につながることができます。例えば機能アッセイ4、したがって、相補的な手法で観測された相互作用を検証するは必要で 。蛋白質だけ弱いか一過性高分子複合体に関連付けられている使用される BN バッファー失われる可能性があります。これを避けるためには、サンプルが架橋、成果物につながることができますか、タンパク質同定を防ぐことができるまたはバッファー条件を最適化することができます。
古典的な 2 D のページとは対照的組み合わせ尿素-SDS-PAGE の疎水性と等電点 (pI) と分子量28ではなく分子量に従って分離し、蛋白質の分離は制限されません、特定の pI の範囲です。古典に類似した 2 D ページ、分離タンパク質シングル スポットとして表示されますが、対角線上線4,28 (図 5, 図 6)。ライン28下より親水性タンパク質が見つかったに対し、この対角線上のスポットで多くの疎水性タンパク質が表示されます。このプロトコルで使用されるポリアクリルアミド濃度は 25 に 80 kDa のタンパク質をよく分離されます。小さいまたは大きいタンパク質の分離、ポリアクリルアミドを許可するように濃度を変えることができるまたは勾配ゲルを 3 番目のディメンションで使用できます。3 D ページ (図 6) で区切られた複雑な IV (図 3) のコンポーネントは、トリプシン消化、および質量分析法による分析をカットされました。これは、いくつかの tRNA のリガーゼの特定につながった。他の複合体のコンポーネントをされている最近、 4を公開します。当社の 3 D ページには、異なるリガーゼ、すなわちアスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、リジン、グリシンのリガーゼ、同じような分子量 (表 3) との分離が有効になります。メチオニン tRNA 特定プローブを使用して、我々 は複雑な IV 内可能性がありますバインドされた tRNA を検出することができたが、フルレングス tRNA または tRNA 断片が、複雑な場合は使用プローブと差別されることはできません。プロテアーゼ消化師部 sap である核酸は本当にコンプレックス内連結および共同移行ではない場合、チェックするには、サンプルは適切なマイグレーション制御として役立つかもしれない。
それは師部篩管内でタンパク質翻訳することができます行われる師部サンプル4,7で伸長因子と同様、全体のリボソームのほとんどのコンポーネントが検出されましたので以前推測されています。TRNA と tRNA のリガーゼの私達の見つけることはこの考えを支持するようです。しかし、カボチャから篩部のサンプルで現在の tRNA 断片が翻訳42の強力な阻害剤に示されている、機能的なリボゾーム欠席4翻訳が場所を取ることができないことを示唆するように見えます。
一緒に取られて、ここで提示されたプロトコルは、高解像度の個々 のコンポーネントのネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルと分離からも RNP 複合体の分離と同定をことができます。このメソッドのアプリケーションは新規タンパク質と師部サンプル RNP 複合体の検出を有効し、したがってこの専門性の高い工場区画の新機能を解明することができます。

師部の長距離導管高等植物の有機性栄養素の配分に欠かせないが成長と発展、病原体の防御と悪影響への適応の重要な多くの異なるプロセスに関与するも環境条件。イオン、植物ホルモン、または自分自身の代謝物のような小さなエフェクタは、ほかのタンパク質と Rna のような高分子最近潜在的な信号として浮上しています。
研究は、蛋白質の師部読み込みがサイズ依存と伴細胞 (CC) の接続孔 plasmodesmal 単位のサイズ排除限界 (SEL) で制御したことを示されているふるいの要素 (SE) に 10 の範囲に通常ある、> 67 kDa の1,2,3しかし、にもかかわらずこれらのサイズ制限より大きい蛋白質および蛋白質の複合体は、サイズ排除4のアイデアに挑戦師部システム内発見されている、推奨5 、CC からタンパク質が SE にも非特異的失われて。.
物質として大きなリボ核蛋白質複合体は、生合成・ セル6の構造の整合性の維持に極めて重要な役割を再生します。4、7を師部携帯タンパク質とリボ核蛋白質複合体に存在する証拠があるが、その機能についてはほとんど知られている日付に。篩ふるいの要素: タンパク質と RNP 複合体が関与している長距離輸送および/または信号8,9。その組成変動を受ける環境を勉強して転体の機能の解明や、ストレス条件が必要です。そのためには、ネイティブ複合体を分離する必要があり、そのコンポーネントは、十分な解像度と分離しなければなりません。
師部から高分子量複合体を分離、十分な質と量の sap サンプルを取得するの先決です。師部をサンプリングするために使用できる手法は、興味の植物種に依存します。師管液を取得する 3 つの主な方法存在10: 昆虫 stylectomy11、EDTA 促進溶出12、および自発的な滲出物13。
シロイヌナズナ(a)、研究所、世界中で主要なモデル プラントからの師部のサンプルは、EDTA 促進溶出やアブラムシ stylectomy14,15でのみ取得できます。両方のメソッドは、非常に希釈師部 sap または非常に低いサンプル量に します。EDTA 促進溶出も汚染しやすい、実際師部組成16を表さないことがあります。自発師部滲出物は、植物の部分を切断は簡単に収集した13,17,18をすることができます師部樹液の自然放出につながる、ウリ、ルピナス、ユッカなど植物に限定 19。我々 は最近篩分析のための適切なモデル システムとしてナタネ (ナタネ) を設立、シロイヌナズナの近親と師管液のいくつかマイクロリットルを示されている小切開から取得できますので高純度4,8,20であります。さらに、ナタネのゲノム塩基配列は 2014年21にリリースされました。
アブラムシの stylectomy を除いて説明すべての師部コレクション方法は周囲のサンプリング、現場組織の損傷を含めるし、師管液の組成は、損傷に応答変更可能性があります。したがってサンプリング法に関係なく、師部サンプルの品質をチェックする不可欠です。例えばRNase 活動22,23Rubisco8,24プライマーと PCR または砂糖の分析による決定により収集された師部 sap の品質管理のさまざまな方法があります。組成8。
サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖密度遠心明確な分子量カット膜によるサンプルろ過などを分離し、タンパク質複合体を分離するさまざまな方法を適用できるトレードオフです。ただし、これらのアプローチは高解像度を許さない。最初 Schäggerらによって記述された青ネイティブ ページ (BN-PAGE) と呼ばれる手法。25日は解像度の面で優れています。それは正常に様々 な細胞小器官や細胞可溶化物の相対的な存在量26,27から大規模なネイティブ タンパク質の分子量を決定するため使用されました。
さらにタンパク質の複雑な組成の解明、複雑な部品の完全な分解につながる条件の変化の下で個々 のコンポーネントを分離する必要は。これは SDS ページ28,29またはより高い解像度を実現、等電集中 (IEF) の 2 番目の次元で続いて SDS ページ30の third dimension との識別をその後に 2 番目の次元によって達成することができます。質量分析法を用いたタンパク質。
このプロトコルでは、ナタネ植物から純粋な師部樹液の採取・ BN-PAGE-トリス-トリシン-尿素-ページおよび SDS のページを組み合わせて 3 D 電気泳動のアプローチを使用してこのような師部サンプルからタンパク質複合体の分析について説明します。複雑なコンポーネントは、質量分析法による識別されますその後分離されたタンパク質。さらに、紹介するブルー ネイティブ北しみが付くこと大きい RNP 複合体4Rna の検出を許可する方法としてアプローチの適用性を拡張します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 反応チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液 (29:1) 溶液</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液 (37.5:1) 溶液</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96% エタノール</td><td>カール ロス</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>カール ロス</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アルミニウム - (14-18) - 水和物</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキソ二硫酸アンモニウム (APS)</td><td>カール ロス</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>ビストリス</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>遠心濃縮器 例 Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td> <td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>化学発光核酸検出モジュールキット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィー論文 例: 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>エタノールabs。</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム 例: Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン e.g. GFL ハイブリダイゼーションインキュベーター 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射針 (0.8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG ゲルコーム、厚さ 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>RNA の標識 例Biotin 3'end DNAラベリングキット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4&ndash;16% Bis-Tris protein gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nylon membrane e.g. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-phosphoric acid</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler prestained protein ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Power supply for Gel electrophoresis EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA クリーンアップキット</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>セミドライブロット e.g. から入手可能です。Fastblot 43B セミドライブロット</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>トリゾール試薬</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb 超高感度ハイブリダイゼーションバッファー</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV 架橋剤 例 Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>社製 垂直電気泳動装置 例えばXCell SureLock Mini-Cell または Mini-Protean III System</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックまたはバイオラッド</td><td>EI0001 または1658004</td><td></td></tr><tr><td>ワイパー 例えば KIMWIPES Delicateタスクワイパーキン</td><td>バリークラーク</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 d ページのナタネから師部 sap サンプリング

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

高等植物の篩管液をサンプリング、しばしば骨の折れると植物種に大きく依存。ただし、別の植物種の変性条件下のプロテオーム研究を達成できます。ネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質: 師部のサンプルから核酸複合体、まだやっとのことで分析されているこの特殊な区画の維持または長距離シグナル伝達で重要な役割を果たしている可能性が。大きな分子は、青ネイティブ ゲル電気泳動法 (BN] ページ) を使用して分離できます。その後ナトリウム ドデシル硫酸ページ (SDS-PAGE) による、タンパク質成分を分離できます。ただし、同じような分子量が付いている蛋白質共同移行、質量分析法によるタンパク質の同定を妨げることができるか。BN-PAGE-を組み合わせて 2 つ異なる変性ゲル電気泳動手順、すなわちトリス トリシン尿素と SDS ページの親水性/疎水性に従ってタンパク質を追加分離できます、解像度と成功を増やしますタンパク質同定。それも違いだけで、翻訳後修飾タンパク質を区別することができます。さらに、高分子複合体の RNA コンポーネントを識別するには、青いネイティブ北しみが付くことを適用できます。我々 のプロトコルが蛋白質およびネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルで発生するリボ核タンパク質 (RNP) 複合体の RNA 成分の解明に適していることを示します。青を組み合わせること 2 つの異なる変化ページ手順でネイティブ ページは異なった種類の大きい蛋白質の複合体を分離することができ、質量分析法による部品の高められた識別率ができます。さらに、プロトコルは同時に 1 つの蛋白質の複合体の内で潜在的にバインドされている核酸を検出する十分な堅牢です。

大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2 つのページを持つ。

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

この3D-PAGE手順の全体的な目標は、Brassica napus ploem sapからタンパク質とリボ核タンパク質の複合体を分離し、それぞれの核酸とタンパク質成分を同定することです。この方法は、生化学と植物生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、ストレス下での師部複合体の組成を分析できます。この技術の主な利点は、純粋な師部樹液を収集し、核酸とタンパク質成分を同時に分析できることです。この手法は、アブラナの師部系におけるタンパク質タンパク質やタンパク質核酸相互作用に関する知見を得ることができますが、ウリ科、ルピナス、ユッカなどの他の植物の師部分析にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、特定の師部タンパク質のタンパク質とRNAの相互作用パートナーを特定しようとしたときにでした。まず、生後8週間のB.napus植物の花序茎に、0.8ミリメートルの皮下注射針を使用して数回穴を開けます。同じ植物や他の植物に他のいくつかの花序茎を穿刺して、十分な師部樹液を取得します。各負傷部位の最初の一滴を濾紙で拭き取ります。最初の液滴を取り除いた後、ピペットを使用して残りの液滴を収集します。そして、それらを予め冷却した円錐形の1.5ミリリットル反応チューブに移します。次に、収集した滲出液を氷のない冷却システムを使用して摂氏マイナス20度で保存します。それ以上の液滴形成が観察されなくなるまで、ただし1時間以内に液滴の収集を続けます。次に、師部サンプルを分子量カットオフ10,000ダルトンの遠心濃縮器に加え、初期容量の約1/6まで濃縮します。次に、濃縮されたサンプルを摂氏4度と20,000gで少なくとも15分間遠心分離して、ほこりの粒子を取り除きます。ブルーネイティブPAGEを行うには、ゲルチャンバーを組み立てます。そして、半分に紺色のカソードバッファーBを追加し、カソードバッファーでウェルを洗浄します。ウェルあたり20〜30マイクログラムの濃縮タンパク質サンプルを、市販のBis-Trisラジアントゲルに少なくともトリプリケートでロードします。チャンバーにカソードバッファーとアノードバッファーを充填し、サンプルがゲルの1/3を通過するまで、摂氏4度と150ボルトでゲルを泳動させます(これには20〜30分かかります)。実行を一時停止し、ダークブルーのカソードバッファBをライトブルーのカソードバッファB1/10と交換します。ランを再開し、青い前面がゲルから溶出し始めるまで続けます(これには120〜180分かかります)。天然の青色ゲルからゲルレーン全体を切り取り、セミドライブロッティングでナイロンメンブレンに移し、メンブレンの上下のゲル境界に鉛筆で印を付けます。吸い取り後、DEPC処理水でメンブレンを洗い、2枚の濾紙の間に挟んで乾燥させます。これに続いて、120, 000マイクロジュール/センチメートルの二乗の印加エネルギーで、ブロットメンブレンのUV架橋を行います。次に、UV架橋膜を6ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーで、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏68度で60分間プレハイブリダイズします。さらに、4マイクロリットルの3プライムビオチン化プローブを含む1ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーをメンブレンに加えます。次に、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏68度から37度に冷却しながら、プローブとメンブレンを一晩インキュベートします。翌日、2x SSCと0.1%SDSを含むバッファーでメンブレンを室温で5分間洗浄し、非特異的に結合したプローブを除去します。ストレプトアビジンHRPコンジュゲートと西洋ワサビペルオキシダーゼ基質としてのルミノールを用いて、メンブレン上の3プライムビオチン化プローブを検出します。これにより、高感度の化学発光反応が起こります。青いネイティブゲルからシングルバンドを物品税化します。サンプルのバンドを1.5ミリリットルの円錐形反応チューブ内で平行なレーンでランし、さらに濃縮された複雑なタンパク質を実現します。12%Tris-Tricine尿素ゲルを調製するには、2枚のガラスプレートの間に10ミリリットルのゲル溶液Aを注ぎ、イソプロパノールで覆います。重合後、イソプロパノールを除去し、ゲルに2〜3ミリリットルのゲル溶液Bを加え、10ウェルコームを挿入します。切除したゲル片を平衡化するために、2x SDSサンプルバッファー1ミリリットルを反応チューブに加えます。試料を室温で10分間インキュベートした後、95°Cの加熱ブロックで約1分間加熱します。次に、サンプルを室温で15分間インキュベートします。これに続いて、同じ複合体を表すいくつかの平衡化ゲル片を1つのゲルポケットに積み重ねます。ゲルチャンバーを組み立てた後、アノードとカソードのランニングバッファーを使用して150ボルトで45〜60分間電気泳動を行います。終了したら、ゲルレーン全体を切除します。カットしたゲルレーンを酸性緩衝液中で20分間インキュベートします。次に、pH 6.8 の 125 ミリモル Tris-HCL でさらに 20 分間平衡化します。レーンに応じて15%SDS分離ゲル溶液を注ぎます。ゲルが固まったら、イソプロパノールを除去し、4%スタッキングゲル溶液を3ミリリットル加え、IPGゲル用の特別なコームを挿入します。固化後、平衡化ゲルレーンをSDSゲルに移し、微量のブロモフェノールブルーを添加した1x SDSランニングバッファー中の0.5%アガロースでゲルを覆います。ゲルチャンバーを組み立てた後、ゲルを150ボルトで60分間泳動します。終了したら、ゲルをコロイド状Kumasi溶液で染色し、その後の質量分析に使用します。最後に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型分光法を使用して、目に見えるタンパク質スポットを分析します。純粋な師部サンプルから得られた代表的な結果をここに示します。汚染されていない師部サンプルは、チオレドキシン年齢の可視バンドを示していますが、RuBisCOおよび花粉コートタンパク質のシグナルは観察されません。B.napus phroleem sapのBN PAGEの後に、少なくとも4つの主要なタンパク質複合体バンドが見えるようになります。師部樹液の濃度が低すぎたり高すぎたりすると、複合体を明確に分離できません。3D PAGEでは、尿素ゲルとSDS-PAGEゲルでタンパク質の移動挙動が異なるため、高分解能の分離が観察されます。通常、単一の複合体に属するタンパク質は、ゲルを横切る対角線として表示されます。この線より上のタンパク質は疎水性が高くなりますが、線より下のタンパク質はより親水性です。BNノーザンブロッティングは、特定のtRNAが1つの特定の複合体にのみ存在することを示しています。質量分析により、この複合体は主にtRNAリガーゼを含んでいることが示され、BNノーザンブロッティングによって見出されるtRNA結合活性が確認されました。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3日で行うことができます。この手順を試行する際は、質量分析を妨げるカロチン汚染を最小限に抑えるために、手袋と白衣を着用することを忘れないでください。この手順に続いて、採取した師部樹液を用いたザイモグラムや酵素アッセイなどの他の方法を実行して、複雑な活性や阻害研究などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、植物科学の分野の研究者が、さまざまな植物種の師部サンプルのマルチサブユニット複合体を探索する道を開きました。このビデオを見れば、アブラナ属植物から師部樹液を単離する方法、およびタンパク質タンパク質とタンパク質核酸複合体を単離および分析する方法について十分に理解できるはずです。SDS、アクリルアミド、TMETでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋や白衣を着用してフードの下で作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。...

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。...

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

師部樹液の成分だけでなく、そのロードと長距離輸送のメカニズムの知識は、植物の開発とストレス/病原体応答と輸送を同化の長距離シグナルの理解に不可欠である。本稿では、EDTA-促進法を用いて師部滲出液のコレクションを記述します。...

の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はEDTA-促進法を用いた滲出

標的タンパク質分解は、細胞機能の主要な調節機構を表す。その後、26Sプロテアソームのために、分子「タグ」を提供する標的タンパク質にユビキチン鎖が付加し保存され、ユビキチン-プロテアソーム経路を介して行われます。ここでは、タンパク質のプロテアソーム分解のための、シンプルで信頼性の高い無細胞アッセイを記述します。...

植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ

このプロトコルは、フランスの豆植物(Phaseolus...

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用インゲンマメ例として

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。...

シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

本プロトコルは、 Plasmodiophora brassicae によって誘導されるゴールの組織学的観察のための最適化された方法を記載する。胚軸のビブラトーム切片は、蛍光イメージングの前に除去され、疾患進行中の転写因子と植物ホルモンの関与を研究します。このプロトコルは、樹脂包埋の制限を克服し、蛍光タンパク質の プランタ 可視化を可能にします。...

透明化顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせて、アブラナ原虫に対する遺伝子発現の変化と生理学的応答を視覚化

学ぶ3D-PAGE法によるBrassica napus師部サップからのタンパク質・リボ核蛋白質複合体の分離と同定。BN-PAGEと変性電気泳動を組み合わせ、タンパク質と核酸成分を高分解能で解析する手法です。

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

さらに動画を探す