タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

この3D-PAGE手順の全体的な目標は、Brassica napus ploem sapからタンパク質とリボ核タンパク質の複合体を分離し、それぞれの核酸とタンパク質成分を同定することです。この方法は、生化学と植物生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、ストレス下での師部複合体の組成を分析できます。

この技術の主な利点は、純粋な師部樹液を収集し、核酸とタンパク質成分を同時に分析できることです。この手法は、アブラナの師部系におけるタンパク質タンパク質やタンパク質核酸相互作用に関する知見を得ることができますが、ウリ科、ルピナス、ユッカなどの他の植物の師部分析にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、特定の師部タンパク質のタンパク質とRNAの相互作用パートナーを特定しようとしたときにでした。

まず、生後8週間のB.napus植物の花序茎に、0.8ミリメートルの皮下注射針を使用して数回穴を開けます。同じ植物や他の植物に他のいくつかの花序茎を穿刺して、十分な師部樹液を取得します。各負傷部位の最初の一滴を濾紙で拭き取ります。

最初の液滴を取り除いた後、ピペットを使用して残りの液滴を収集します。そして、それらを予め冷却した円錐形の1.5ミリリットル反応チューブに移します。次に、収集した滲出液を氷のない冷却システムを使用して摂氏マイナス20度で保存します。

それ以上の液滴形成が観察されなくなるまで、ただし1時間以内に液滴の収集を続けます。次に、師部サンプルを分子量カットオフ10,000ダルトンの遠心濃縮器に加え、初期容量の約1/6まで濃縮します。次に、濃縮されたサンプルを摂氏4度と20,000gで少なくとも15分間遠心分離して、ほこりの粒子を取り除きます。

ブルーネイティブPAGEを行うには、ゲルチャンバーを組み立てます。そして、半分に紺色のカソードバッファーBを追加し、カソードバッファーでウェルを洗浄します。ウェルあたり20〜30マイクログラムの濃縮タンパク質サンプルを、市販のBis-Trisラジアントゲルに少なくともトリプリケートでロードします。

チャンバーにカソードバッファーとアノードバッファーを充填し、サンプルがゲルの1/3を通過するまで、摂氏4度と150ボルトでゲルを泳動させます(これには20〜30分かかります)。実行を一時停止し、ダークブルーのカソードバッファBをライトブルーのカソードバッファB1/10と交換します。ランを再開し、青い前面がゲルから溶出し始めるまで続けます(これには120〜180分かかります)。

天然の青色ゲルからゲルレーン全体を切り取り、セミドライブロッティングでナイロンメンブレンに移し、メンブレンの上下のゲル境界に鉛筆で印を付けます。吸い取り後、DEPC処理水でメンブレンを洗い、2枚の濾紙の間に挟んで乾燥させます。これに続いて、120, 000マイクロジュール/センチメートルの二乗の印加エネルギーで、ブロットメンブレンのUV架橋を行います。

次に、UV架橋膜を6ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーで、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏68度で60分間プレハイブリダイズします。さらに、4マイクロリットルの3プライムビオチン化プローブを含む1ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーをメンブレンに加えます。次に、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏68度から37度に冷却しながら、プローブとメンブレンを一晩インキュベー

翌日、2x SSCと0.1%SDSを含むバッファーでメンブレンを室温で5分間洗浄し、非特異的に結合したプローブを除去します。ストレプトアビジンHRPコンジュゲートと西洋ワサビペルオキシダーゼ基質としてのルミノールを用いて、メンブレン上の3プライムビオチン化プローブを検出します。これにより、高感度の化学発光反応が起こります。青いネイティブゲルからシングルバンドを物品税化します。

サンプルのバンドを1.5ミリリットルの円錐形反応チューブ内で平行なレーンでランし、さらに濃縮された複雑なタンパク質を実現します。12%Tris-Tricine尿素ゲルを調製するには、2枚のガラスプレートの間に10ミリリットルのゲル溶液Aを注ぎ、イソプロパノールで覆います。重合後、イソプロパノールを除去し、ゲルに2〜3ミリリットルのゲル溶液Bを加え、10ウェルコームを挿入します。

切除したゲル片を平衡化するために、2x SDSサンプルバッファー1ミリリットルを反応チューブに加えます。試料を室温で10分間インキュベートした後、95°Cの加熱ブロックで約1分間加熱します。次に、サンプルを室温で15分間インキュベートします。

これに続いて、同じ複合体を表すいくつかの平衡化ゲル片を1つのゲルポケットに積み重ねます。ゲルチャンバーを組み立てた後、アノードとカソードのランニングバッファーを使用して150ボルトで45〜60分間電気泳動を行います。終了したら、ゲルレーン全体を切除します。

カットしたゲルレーンを酸性緩衝液中で20分間インキュベートします。次に、pH 6.8 の 125 ミリモル Tris-HCL でさらに 20 分間平衡化します。レーンに応じて15%SDS分離ゲル溶液を注ぎます。

ゲルが固まったら、イソプロパノールを除去し、4%スタッキングゲル溶液を3ミリリットル加え、IPGゲル用の特別なコームを挿入します。固化後、平衡化ゲルレーンをSDSゲルに移し、微量のブロモフェノールブルーを添加した1x SDSランニングバッファー中の0.5%アガロースでゲルを覆います。ゲルチャンバーを組み立てた後、ゲルを150ボルトで60分間泳動します。

終了したら、ゲルをコロイド状Kumasi溶液で染色し、その後の質量分析に使用します。最後に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型分光法を使用して、目に見えるタンパク質スポットを分析します。純粋な師部サンプルから得られた代表的な結果をここに示します。

汚染されていない師部サンプルは、チオレドキシン年齢の可視バンドを示していますが、RuBisCOおよび花粉コートタンパク質のシグナルは観察されません。B.napus phroleem sapのBN PAGEの後に、少なくとも4つの主要なタンパク質複合体バンドが見えるようになります。師部樹液の濃度が低すぎたり高すぎたりすると、複合体を明確に分離できません。

3D PAGEでは、尿素ゲルとSDS-PAGEゲルでタンパク質の移動挙動が異なるため、高分解能の分離が観察されます。通常、単一の複合体に属するタンパク質は、ゲルを横切る対角線として表示されます。この線より上のタンパク質は疎水性が高くなりますが、線より下のタンパク質はより親水性です。

BNノーザンブロッティングは、特定のtRNAが1つの特定の複合体にのみ存在することを示しています。質量分析により、この複合体は主にtRNAリガーゼを含んでいることが示され、BNノーザンブロッティングによって見出されるtRNA結合活性が確認されました。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3日で行うことができます。

この手順を試行する際は、質量分析を妨げるカロチン汚染を最小限に抑えるために、手袋と白衣を着用することを忘れないでください。この手順に続いて、採取した師部樹液を用いたザイモグラムや酵素アッセイなどの他の方法を実行して、複雑な活性や阻害研究などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、植物科学の分野の研究者が、さまざまな植物種の師部サンプルのマルチサブユニット複合体を探索する道を開きました。

このビデオを見れば、アブラナ属植物から師部樹液を単離する方法、およびタンパク質タンパク質とタンパク質核酸複合体を単離および分析する方法について十分に理解できるはずです。SDS、アクリルアミド、TMETでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋や白衣を着用してフードの下で作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。