行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

動作マウスにおける海馬シータ振動 (5-10 Hz) の選択を操作する光遺伝学、電気生理学的記録の使用について述べる。リズムの同調性は、ローカル フィールド ポテンシャルを使用して監視されます。光と薬理遺伝学的抑制の組み合わせは、海馬同期の遠心性の読み出しをアドレスします。

この方法は、特別なナビゲーションにおけるシータ振動の因果関係や関連する行動など、神経生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、行動マウスの海馬シータ振動の周波数と規則性をリアルタイムで制御できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の元大学院生であるフランツィスカ・ベンダー博士です。

まず、完全に麻酔をかけたマウスを脳定位固定装置フレームに固定します。内側中隔の上に穴を開けます。パラフィンフィルム上のウイルスの液滴に注射針の先端を沈め、液体のレベルを観察しながら、毎分約500ナノリットルでウイルスを慎重に吸い上げます。

注射針に空気が入るのを防ぐために、ウイルスが完全に取り込まれる前に離脱を止めてください。ペーパーティッシュで針を拭きます。ウイルスとオイルが気泡で分離されていることを確認し、チューブ上のウイルスのレベルをマークします。

針を開頭術の上に配置し、最初の注入点でゆっくりと脳に挿入します。毎分100〜150ナノリットルの速度で450ナノリットルのウイルスを注入します。注射後、10分間待ちます。

10分後、針を慎重に0.1ミリメートル上に動かし、さらに5分待ちます。マイクロストリッパーを使用して、ファイバーがファイバースプールに接続されたままの状態で、マルチモード光ファイバーから125マイクロメートルのクラッディングを剥がします。次に、ダイヤモンドナイフを使用して、繊維を約2〜3センチの長さにカットします。

光ファイバーを内径126ミクロンのジルコニアセラミックスティックフェルールに挿入します。繊維の約0.5〜1ミリメートルがフェルールの凸面から突き出ている必要があります。針を使用して、フェルールの両端にエポキシ接着剤を1滴塗布しますが、フェルールの側面には塗布しません。

乾燥後、3ミクロンのグリットでダイヤモンドラッピングファイバー研磨フィルムを使用して、フェルールの凸面を研磨します。タングステンワイヤーアレイを準備するには、まず、テープの粘着面に数個の100ミクロンシリカチューブガイドを接着します。次に、鉗子を使用して、ガイドチューブに絶縁された45ミクロンのタングステンワイヤーを通します。

次に、メスを使用して、長さ約5ミリメートルの6本のエナメル絶縁細い銅結合ワイヤーの両端から絶縁体を剥がします。次に、長さ約2〜3センチメートルのアース線の両端から絶縁体を剥がします。被覆を剥がした各ワイヤをナノコネクタピンにはんだ付けします。

各ボンディングワイヤを1本のタングステンワイヤに銀導電性塗料1滴で接続します。乾燥後、銅線を覆うために少量のセメントを塗布します。ナノコネクタの上部にセメントを塗布することは避けてください。

セメントを少なくとも30分間乾燥させた後、鈍いステンレス鋼のはさみを使用して、タングステンワイヤーを5〜20度の角度で切断します。麻酔をかけた動物のきれいな頭蓋骨に直径0.8mmの4つの穴を開けることから始めます。冠状縫合糸に吻側に2つの穴を開け、小脳の上に2つの穴を開けます。

次に、インプラントの接地と安定化のためにステンレス鋼の骨ネジを配置します。銅線に接続されたアースネジを小脳の上に配置します。電気生理学的記録中の筋肉のアーチファクトを防ぐために、アーススクリューをセメントで完全に覆います。

すべてのネジを接続するcmentリングを構築します。移植部位の上で開頭術を行い、その後、脳組織の表面に約1マイクロリットルの滅菌生理食塩水を適用します。ステレオタックスを使用して、ワイヤーアレイをゆっくりと開頭術に下げます。

次に、脳組織を保護するために、移植部位の上に約5マイクロリットルの温かい液体ワックスを塗布します。ワイヤーアレイの周囲にセメントを塗布し、頭蓋骨をセメントで覆います。はんだ付け済みのアース線またはアースネジに接続したはんだ付け済みのワイヤーにフラックスを1滴塗布し、はんだ付け機でヒューズします。

最後に、アース線全体をセメントで覆います。パッチコードからの光出力を確認してください。埋め込まれたファイバーの透過率が50%の場合、パッチコードの先端の光出力が20ミリワットであることを確認してください。

ヘッドステージプリアンプを埋め込み型コネクタに接続し、光ファイバーパッチコードを埋め込み型海馬線維に接続して光遺伝学的刺激を行います。測定するパラメータに適した期間のベースライン動作を記録します。ソフトウェアを開いて、刺激発生器を制御します。

[ファイル] をクリックして開き、選択したプロトコル ファイルを選択します。[ダウンロードして開始]をクリックして、光の刺激を開始します。光パルスによるシータリズムの制御を観察します。

ここでは、自発的なシータ振動中の海馬の局所磁場電位が見られます。生理学的なシータリズムの指標であるガンマエンベロープに注意してください。ここでは、光遺伝学的同調中の7ヘルツでの海馬の局所電界電位が見られます。

青いストライプは、光の塗布の時間枠を示しています。ここでは矢印で示されている光パルスによる位相リセットに注意してください。10ヘルツでの海馬の局所電界電位は、光遺伝学的同調を反映しています。

位相ロックされたガンマ エンベロープと、層状オリアンと層半径方向の位相反転は、巻き込み中も維持されることに注意してください。この手法を習得すれば、実験時間は4時間、ウイルス発現には6週間で完了します。この手順を試みる際には、効率的なウイルス形質導入を確保することを覚えておくことが重要です。

光ファイバーインプラントをパッチコードに適切に接続し、自発的な局所電界電位シータ振動の良質を取得します。