成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy の手順をについて説明します。このメソッドは、マウス内耳へのウイルスのベクトル、医薬・小分子を接種する使用ことができます。

この研究の全体的な目標は、成体マウスと新生児マウスの両方における運河瘻造設術に関与する外科的技術を説明することです。この方法は80年代後半に最初に。成人マウスと新生児マウスの両方の蝸牛および前庭末端器官に注射された試薬の広範な分布。

この技術の主な利点は、聴覚と前庭機能への損傷が最小限に抑えられることです。また、必要に応じて、複数の手術を簡単に行うことができます。その手順を実演するのは、私たちの部門のレジデントであるJing-Ying Guo博士です。

まず、ポリイミドチューブをポリエチレンチューブに接続して、注射カニューレを作ります。瞬間接着剤を使用して、少なくとも3つのアプリケーションで接続をシールします。そして、注射カニューレをエチレンオキシドで滅菌します。

次に、30ゲージの針を使用して、ポリエチレンチューブの端を生理食塩水を含むone-CCシリンジに接続します。one-CCシリンジで注射することにより、カニューレに生理食塩水を充填し、ポリイミドチューブとポリエチレンチューブの間の接続部に漏れや詰まりがないか確認します。10マイクロリットルのマイクロシリンジを生理食塩水で排気し、注射カニューレで30ゲージの針に接続します。

次に、マイクロシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付けます。注入速度を0.5マイクロリットル/分に設定し、容量をファストグリーン色素とウイルス検出器AAV8-GFPの場合は1マイクロリットル、ストレプトマイシンの場合は2マイクロリットルに設定します。最後に、マイクロシリンジを1マイクロリットルに引き戻し、注入試薬を抽出して、通常の生理食塩水と注入試薬との間にエアギャップを作ります。

麻酔をかけたマウスを予熱した電気パッドの上に置くことから始めます。電気パッドの温度を摂氏約37度に設定します。動物の目を目の軟膏で覆います。

次に、電気動物クリッパーで左耳介後領域を剃り、75%エタノールで皮膚を3回消毒します。次に、左耳の手術を容易にするために、動物を右横位置に置きます。左後耳介溝から3ミリメートルのところに1〜1.5センチメートルの耳介後切開を行います。

耳介の根元が原点と定義され、頭蓋に平行な平面が3時から9時と定義されている場合、後半規管と外側半規管は通常、耳介の根元から約3ミリメートル、2時から3時の間に位置していることに注意してください。側頭骨を覆っている筋肉を微小鉗子で鈍く解剖して、後半規管と外側半規管を露出させます。その縁は側頭骨の暗い縞模様としてはっきりと見えます。次に、マイクロ鉗子で筋肉の小片を集めて乾かします。

次に、26ゲージの針を使用して後半規管の中央部分に小さな穴を開け、穴からの液体の漏れが後半規管の骨壁の浸透が成功したことを示すようにします。穴をポリイミドチューブの直径より少し大きくします。次に、綿ペレットを使用して後半規管の穴を囲む滲出液を洗浄します。

ポリイミドチューブの先端を、後半規管に、クリュコミューンに向かって、1〜2ミリメートルの深さまで静かに挿入します。ポンプのランボタンを押して注入を開始します。注入後、試薬が広がるまで2分間待ちます。

次に、注射カニューレを取り外し、すぐに筋肉を後半規管の穴に配置します。分離した筋肉と皮下組織を一緒に戻します。5-0縫合糸を使用して切開部を縫合します。

切開部をポビドンヨードで消毒します。最後に、手術が完了したら、37°Cに予熱した電気パッドの上で動物を右の横向きの位置に置き、回復させます。次の手順は、成体マウスと比較して新生児で異なります。

氷で満たされたプラットフォームに横たわる鎮静剤を投与した新生児で、耳介の折り目から後方2ミリメートルから3ミリメートルの耳介後切開を行うことから始めます。次に、26ゲージの針を使用して、柔らかい後半規管にそっと開口部を作ります。開口部を大きくせずにカニューレを後半規管に挿入します。

注射後、筋肉片を使用して開口部を塞ぐのではなく、開口部を覆います。後者は軟後半規管の骨折につながる可能性があるためです。6-0縫合糸を使用して皮膚を閉じます。これは、成体マウスと新生児マウスの内耳の立体画像で、早速緑色色素を小管瘻造設術で投与したものです。

サンプルは手術直後に採取しました。さらに、これらの共焦点画像は、AAV8-GFP注射の30日後に運河ストーマを介して調製された成体マウスの蝸牛と卵形嚢の全マウントを示しています。蝸牛では、GFPはほとんどの内有毛細胞に発現しています。

そして、卵管のクチクラ板の焦点面では、多数の有毛細胞がGFPを発現します。最後に、外傷を負った卵形嚢のこれらの共焦点画像は、AAV8-GFP注射の30日後に運河ストーマを介して取得されました。GFP陽性、ミオシン7A陽性細胞は形質導入された有毛細胞であり、GFP陽性、ミオシン7A陰性細胞は形質導入支持細胞です。

この手順を試行するときは、カニューレの先端が半規管にしっかりと挿入されていること、およびカニューレが曲がったり詰まったりしていないことを確認することが重要です。成体マウスに注射した後、乾燥した筋肉の小片を使用して、半規管の穴を塞ぐことをお勧めします。穴から液体が漏れていないか確認して、完全に密閉されていることを確認してください。

私たちの研究は、小管ストーマ術がマウスの内耳への薬物送達のための効果的で安全なアプローチであることを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば25分で完了できます。このビデオを見た後、三半規管の位置を特定し、カナロストミーを介して成体および新生児マウスの内耳にウイルスベクター、siRNA、幹細胞、または薬物を送達する方法について十分に理解しているはずです。